一種代謝蘆薈苷的微生物篩選及其酶學(xué)性質(zhì)初步研究

牛艷豐，寇正福，劉坐鎮(zhèn)，，許建和，江邦和

(1.華東理工大學(xué)，上海200237;2.上海華震科技有限公司，上海 200237)

一種代謝蘆薈苷的微生物篩選及其酶學(xué)性質(zhì)初步研究

牛艷豐1，寇正福1，劉坐鎮(zhèn)1，2，許建和1，江邦和2

(1.華東理工大學(xué)，上海200237;2.上海華震科技有限公司，上海 200237)

通過(guò)基因工程手段篩選到代謝蘆薈苷的菌種——大腸桿菌(E.coliBL21(DE3)，PET28(a))(ECUST0416，CGMCC NO.6114)，發(fā)酵產(chǎn)生的酶液能夠水解蘆薈苷為蘆薈大黃素。30℃、250r/min條件下發(fā)酵11h，產(chǎn)酶量可以達(dá)到148U/L發(fā)酵液。初步研究了酶液在不同溫度、pH、底物濃度、PBS濃度、NaCl濃度、反應(yīng)時(shí)間下的活性，從而確定酶活測(cè)定的最佳條件為:30℃、pH7.5、5mL粗酶液與5mL 40mmol/L PBS(pH7.5)混合組成反應(yīng)體系、底物濃度3mg/mL、Nacl 0.6%、反應(yīng)時(shí)間為20min。酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)高效液相檢測(cè)，純度為98.5%，酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為73%。質(zhì)譜和核磁共振圖譜結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物為蘆薈大黃素。

蘆薈苷，蘆薈大黃素，優(yōu)化，酶學(xué)性質(zhì)

蘆薈大黃素(aloe－emodin)，又稱蘆薈瀉素，化學(xué)名稱為1，8－二羥基－3－羥甲基蒽醌，是重要的蒽醌類物質(zhì)，主要存在于蘆薈葉表層中，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等一系列生物活性，在醫(yī)藥、保健食品、化妝品、日用洗滌用品行業(yè)上被廣泛應(yīng)用［1］。目前有關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道中，化學(xué)合成制備蘆薈大黃素最常見(jiàn)的方法是以蘆薈苷為起始原料，經(jīng)過(guò)水解氧化反應(yīng)得到蘆薈大黃素。目前，利用蘆薈苷(aloin)制備蘆薈大黃素的方法有鐵鹽催化酸解法［2］、高溫氧化法［3］、過(guò)硫酸鹽氧化法［4］等化學(xué)方法。以上幾種方法要用強(qiáng)酸或高溫或者通入氧氣，需要特殊設(shè)備或者加入大量的金屬鹽，反應(yīng)條件不溫和，對(duì)反應(yīng)設(shè)備要求較高，而且能耗也相對(duì)較高。本文利用微生物產(chǎn)生的酶作為催化劑，采用生物轉(zhuǎn)化蘆薈苷制備蘆薈大黃素，具有反應(yīng)條件溫和、不需要特殊設(shè)備、能耗低、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，是一種新型的生物合成方法。

圖1 蘆薈苷和蘆薈大黃素的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of aloin and aloe－emodin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 帶有卡那抗性的大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)，購(gòu)自上海睿星生物技術(shù)有限公司;篩選培養(yǎng)基 蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，121℃滅菌20min，滅菌后待到55℃左右，加入0.4%蘆薈苷和15μg/mL卡那霉素，搖勻后倒平板;平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基 均為 LB培養(yǎng)基(KanR，滅菌冷卻后添加15μg/mL卡那霉素);K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、酵母膏、蛋白胨等 北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純;蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)品(≥95%)、蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%) 西安天豐生物科技有限公司。

Agilent 1200高效液相色譜 美國(guó)安捷倫科技有限公司;萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;PHS－3B pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;KYC－100B恒溫?fù)u床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SPX－150B－Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;LS－30立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SWCJ－2D超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選 將vector pet28a(NcoI＆EcoRI)載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)菌株，得到帶卡那抗性的大腸桿菌(E.coliBL21(DE3)、PET28(a))。將該菌接種到篩選培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，再?gòu)钠桨逯刑羧尉渑囵B(yǎng)。重復(fù)60個(gè)周期，得到能夠代謝蘆薈苷制備蘆薈大黃素的E.coli(BL21(DE3)、PET28(a)) (ECUST0416，CGMCC NO.6114)菌株。

1.2.2 發(fā)酵方法

1.2.2.1 菌種活化 將菌株用接種針劃線接種于平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.2.2 種子培養(yǎng) 從平板上挑取菌落接種于種子培養(yǎng)基(250mL瓶裝液50mL)，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)4h(至OD600在0.6～1.0之間)，4℃靜置過(guò)夜。

1.2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 按4%接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(250mL瓶裝液50mL)，于30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)11h。

1.2.3 粗酶液制備 發(fā)酵終止后，將發(fā)酵液(含菌體)經(jīng)4℃、12000r/min，離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。

1.2.4 酶反應(yīng)條件研究

1.2.4.1 最適溫度 將30mg蘆薈苷，5mL酶液，5mL PBS(40mmol/L，pH7.5，1.2%NaCl)加入到50mL三角瓶中，分別在20、25、30、35、40、50、60℃條件下，210r/min振蕩反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，以酶活力最大值為100%表示。

1.2.4.2 最適pH 分別將30mg蘆薈苷，5mL酶液，5mL pH不同的PBS(40mmol/L，pH4、5、6、7、7.5、8、9、10，1.2%NaCl)加入到50mL三角瓶中，在30℃、210r/min振蕩反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，以酶活力最大值為100%表示。

1.2.4.3 最適底物濃度 考察了相對(duì)酶活力與蘆薈苷濃度的關(guān)系，分別將0.5、10、20、30、50、75mg蘆薈苷，5mL酶液，5mL PBS(40mmol/L，pH7.5，1.2% NaCl)加入到50mL三角瓶中，分別在30℃、210r/min振蕩反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，以酶活力最大值為100%表示。

1.2.4.4 最適PBS濃度 分別將30mg蘆薈苷，5mL酶液，5mL各種濃度 PBS(0、20、40、80、120、160、200mmol/L，pH7.5，1.2%NaCl)加入到50mL三角瓶中，分別在30℃、210r/min振蕩反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，以酶活力最大值為100%表示。

1.2.4.5 最佳NaCl濃度 分別將30mg蘆薈苷，5mL酶液，5mL PBS(40mmol/L，pH7.5，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5%NaCl)加入到50mL三角瓶中，分別在30℃、210r/min振蕩反應(yīng)20min，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，以酶活力最大值為100%表示。

1.2.4.6 最佳反應(yīng)時(shí)間 分別將30mg蘆薈苷，5mL酶液，5mL PBS(40mmol/L，pH7.5，1.2%NaCl)加入到50mL三角瓶中，分別在30℃、210r/min振蕩反應(yīng)1/3、1/2、1、2、3、5、6、8、9、10h，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酶活，以酶活力最大值為100%表示。

1.2.5 酶活測(cè)定方法

1.2.5.1 酶活單位(U) 在30℃、pH7.5條件下，每小時(shí)每升反應(yīng)體系酶水解蘆薈苷產(chǎn)生的蘆薈大黃素微摩爾數(shù)定義為一個(gè)酶活單位。

1.2.5.2 測(cè)定方法 將5mL酶液、5mL磷酸緩沖液(PBS)(40mmol/L，pH7.5，1.2%NaCl)、30mg蘆薈苷，加入到50mL三角瓶中，30℃、210r/min振蕩反應(yīng)20min，HPLC測(cè)定反應(yīng)液中蘆薈大黃素的含量。

1.2.5.3 液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件［5］色譜柱: Eclipse XDB－C18柱(4.6mm×250mm，5μm);檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;流動(dòng)相:甲醇∶水溶液(80∶20，V∶V);流速: 0.8mL/min;柱溫:室溫。

1.2.6 酶解產(chǎn)物鑒定

1.2.6.1 酶促反應(yīng)制備蘆薈大黃素 將300mg蘆薈苷，50mL酶液，50mL磷酸緩沖液(40mmol/L，pH7.5，1.2%NaCl)加入到500mL三角瓶中，30℃、210r/min振蕩反應(yīng)8h。用200mL甲苯萃取、分液，重復(fù)操作3次，合并萃取液。于60℃真空濃縮至30mL左右。待冷卻至室溫后放置冰箱，在4℃下保持 1h，再在－10℃下保持2h。抽濾，洗滌兩次，60℃真空干燥。HPLC測(cè)定結(jié)晶中蘆薈大黃素的含量，計(jì)算酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜和核磁共振檢測(cè)。

酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率(%)=酶解生成蘆薈大黃素的摩爾數(shù)/酶解前加入蘆薈苷的摩爾數(shù)×100

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(ESI)離子源;噴霧電壓4.5kV;毛細(xì)管溫度200℃;毛細(xì)管電壓45V;鞘氣(N2)流速40個(gè)單位;流動(dòng)相:甲醇∶0.01mol/L乙酸銨水溶液(50∶50，V∶V);流速:0.20mL/min;負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜全掃描。

1.2.6.3 核磁共振條件 在Varina XL 400(400MHz)超導(dǎo)核磁共振儀上進(jìn)行。以DMSO－d為溶劑，工作頻率為400.13MHz。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選和培養(yǎng)篩選出的帶卡那抗性的大腸桿菌E.coliBL21

(DE3)，在培養(yǎng)時(shí)篩選培養(yǎng)基變?yōu)樽丶t色，液體培養(yǎng)基變成黑紅色。該大腸桿菌在30℃、210r/min條件下培養(yǎng)11h，產(chǎn)酶量可以達(dá)到148U/L發(fā)酵液。

2.2 酶反應(yīng)條件研究

2.2.1 最適反應(yīng)溫度 不同溫度對(duì)該酶促反應(yīng)的影響如圖2所示。從圖2中可以看出，酶活力先是隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度為30℃時(shí)達(dá)到最大，而后隨著溫度的升高逐漸下降。因此，反應(yīng)的最適溫度為30℃，過(guò)高的溫度會(huì)使酶不可逆失活。

圖2 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on enzyme activity

2.2.2 最適pH 不同pH對(duì)酶活影響如圖3所示。由圖3中可以看出，pH在4～6之間酶活上升緩慢，介于6與7.5之間時(shí)，酶相對(duì)活力急劇上升，而在pH大于7.5時(shí)，酶相對(duì)活力急劇下降。因此，該酶促反應(yīng)對(duì)pH極其敏感，最適pH為7.5。

圖3 pH對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity

2.2.3 底物濃度對(duì)酶活的影響 結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，酶活力隨底物濃度的增加而增加，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)3mg/mL時(shí)，酶活力趨于穩(wěn)定?？梢?jiàn)該酶促反應(yīng)最適底物濃度為3～8mg/mL，選取3mg/mL為最適底物濃度。

圖4 蘆薈苷濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of aloe concentration on enzyme activity

2.2.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)濃度對(duì)酶活的影響 不同濃度的PBS對(duì)酶活的影響如圖5所示。從圖5中可以看出，酶活力隨PBS濃度的增加而增加，當(dāng)PBS濃度為40mmol/L時(shí)，酶相對(duì)活力最高，而后，隨著PBS濃度增大，酶活力下降。因此，最佳PBS濃度為40mmol/L。

2.2.5 NaCl濃度對(duì)酶活的影響 結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出，酶活力隨NaCl濃度的增加而增加，當(dāng)NaCl終濃度為0.6%時(shí)，酶相對(duì)活力最高，隨后，隨著NaCl濃度增大，酶活力下降。故NaCl最佳終濃度為0.6%。

圖5 磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of phosphate buffer on enzyme activity

圖6 NaCl濃度對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of sodium chloride on enzyme activity

2.2.6 反應(yīng)時(shí)間 酶促反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖7所示。從圖中可以看出，在20～60min內(nèi)，酶相對(duì)活力急劇下降，蘆薈大黃素含量不斷上升。1～10h內(nèi)酶活下降速度減慢，蘆薈大黃素的含量持續(xù)積累。在8～10h內(nèi)，蘆薈大黃素含量基本保持不變。因此，測(cè)定酶活的最佳反應(yīng)時(shí)間為20min，使用酶活制備蘆薈大黃素最佳反應(yīng)時(shí)間為8h。

圖7 酶活與蘆薈大黃素總量隨反應(yīng)時(shí)間的變化Fig.7 Effect of reaction time on enzyme activity and aloe－emodin production

2.3 酶解產(chǎn)物鑒定

產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度為98.5%，酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為73%。產(chǎn)物進(jìn)行負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜全掃描，質(zhì)譜圖如圖8所示，顯示產(chǎn)物分子量為270，與文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道的蘆薈大黃素的分子量一致。產(chǎn)物核磁共振圖譜如圖9所示，圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的蘆薈大黃素的結(jié)構(gòu)一致。由此確定產(chǎn)物為蘆薈大黃素。

3 結(jié)論

本文篩選得到水解蘆薈苷為蘆薈大黃素的菌株，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為蘆薈大黃素的制備提供了一種新型方法。

圖8 酶解產(chǎn)物質(zhì)譜分析圖Fig.8 Mass spectrum of the enzymatic－biotransformated product

圖9 酶解產(chǎn)物的核磁共振圖譜Fig.9 Nuclear magnetic resonance the enzymatic－biotransformated product

以蘆薈苷為唯一碳源，結(jié)合基因工程技術(shù)篩選出了代謝蘆薈苷的菌種——大腸桿菌(E.coliBL21 (DE3)，PET28(a))，在培養(yǎng)時(shí)可以使篩選培養(yǎng)基變?yōu)樽丶t色，使液體培養(yǎng)基變成黑紅色。發(fā)酵產(chǎn)生的酶液能夠水解蘆薈苷為蘆薈大黃素，產(chǎn)酶量可以達(dá)到148U/L發(fā)酵液。

初步研究了酶液在不同溫度、pH、底物濃度、PBS濃度、NaCl濃度、反應(yīng)時(shí)間下的活性，從而確定酶活測(cè)定的最佳條件為:30℃、pH7.5、5mL粗酶液和5mL 40mmol/L PBS(pH7.5)混合組成反應(yīng)體系、底物濃度3mg/mL、NaCl 0.6%、反應(yīng)時(shí)間為20min。酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)高效液相檢測(cè)，純度為98.5%，酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為73%。質(zhì)譜圖和核磁共振圖譜結(jié)果表明，酶解產(chǎn)物為蘆薈大黃素。

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Microbiological screening for aloin metabolism and preliminary study of its enzymatic properties

NIU Yan－feng1，KOU Zheng－fu1，LIU Zuo－zhen1，2，XU Jian－h(huán)e1，JIANG Bang－h(huán)e2
(1.East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China;
2.Shanghai Huazhen Sci.＆Tech.Co.，Ltd.，Shanghai 200237，China)

AE.coli(BL21(DE3)，PET28(a))(ECUST0416，CGMCC NO.6114)was obtained by Genetic Engineering Technology as the target bacteria which produced protease converting aloin into aloe－emodin.148U of protease in 1L fermented culture medium could be achieved under the fermentation conditions as 30℃，250r/min for 11h.The enzymatic activity was studied and the best activity determination method was:5mL crude enzyme，5mL 40mmol/L Phosphate Buffer(pH7.5)，Snbstrate concentration 3mg/mL，NaCl 0.6%，reaction at 30℃ and pH7.5 for 20min.The enzymatic biotransformed product was determined by HPLC with a purity of 98.5%and identified as aloe－emodin by MS and NMR.

aloin;aloe－emodin;optimize;enzyme properties

Q939.97

A

1002－0306(2012)21－0184－04

2012－04－05

牛艷豐(1985－)，男，碩士，研究方向:生物化工工藝優(yōu)化。