岷山紅三葉草異黃酮合酶基因的克隆及序列分析

胡煥煥，劉 瑞，姬國(guó)杰，李衛(wèi)東，豐慧根，*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，河南新鄉(xiāng) 453000;

2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

岷山紅三葉草異黃酮合酶基因的克隆及序列分析

胡煥煥1，劉 瑞2，姬國(guó)杰1，李衛(wèi)東1，豐慧根1，*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系，河南新鄉(xiāng) 453000;

2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000)

從岷山紅三葉克隆異黃酮合酶基因，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析。建立岷山紅三葉愈傷組織培養(yǎng)體系，采用RT－PCR擴(kuò)增從愈傷組織總RNA中分離了異黃酮合酶基因，并將其克隆到pGEM－T Easy載體，測(cè)序，得到全長(zhǎng)1575bp的片段。序列分析表明，異黃酮合酶基因含1575個(gè)核苷酸，和大豆等其他植物中異黃酮合酶具有很高的同源性。

岷山紅三葉，異黃酮合酶，基因克隆，序列分析

岷山紅三葉產(chǎn)于甘肅省岷縣，也稱紅車軸草，是著名珍稀的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草。1944年由美國(guó)引進(jìn)，在岷縣已有60余年的種植歷史，經(jīng)多年的選育、馴化，成為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)草種。1987年經(jīng)全國(guó)飼料牧草品種審定委員會(huì)審定登記并命名為岷山紅三葉，被譽(yù)為中國(guó)第一草［1］。岷山紅三葉中異黃酮含量是1.0%～2.6%，是大豆異黃酮含量的8～10倍［2］。其提取物異黃酮類的主要成分是芒柄花素、鷹嘴豆牙素、異黃酮、染料木素、染料木甙、大豆甙元、大豆甙等，其中鷹嘴豆牙素A和芒柄花素含量最高［3］。并且含有大豆所沒有的異黃酮—鷹嘴豆芽素A、B(被譽(yù)為“女性生命素”)，而且比大多數(shù)異黃酮的雌激素樣活性高。紅三葉異黃酮作為天然植物雌激素是深受國(guó)際市場(chǎng)歡迎的健康食品。研究表明，紅三葉異黃酮能調(diào)整人體內(nèi)分泌，使皮膚細(xì)膩富有彈性;有效預(yù)防骨質(zhì)疏松，改善睡眠，對(duì)女性更年期綜合癥及其他因雌激素下降引發(fā)的各種疾病，具有獨(dú)特的功效，又被稱為“女子魅力因子”［4］;能降低血脂、預(yù)防冠心病、止痛消腫、抗感染、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、延緩衰老等;同時(shí)異黃酮還是一種潛在的抗癌物質(zhì)，對(duì)結(jié)腸癌、乳腺癌等有防治作用。異黃酮的合成源自類黃酮生物合成途徑中生成的中間代謝產(chǎn)物黃烷酮。催化黃烷酮進(jìn)入異黃酮合成途徑的第一步反應(yīng)酶為異黃酮合酶，是異黃酮合成途徑的關(guān)鍵酶［5－6］。為利用異黃酮的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)采用RT－PCR方法克隆岷山紅三葉全長(zhǎng)cDNA，對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，為進(jìn)一步研究植物異黃酮的生物合成以及進(jìn)行異黃酮生物工程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

岷山紅三葉(Trifolium Pratense Minshan);宿主菌Escherichia coliDH5α 為本實(shí)驗(yàn)室保存;T載體pUGM－T Easy Promege公司;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Taq酶 NEB公司;DL2，000TMDNA Marker、DL10，000TMDNA Marker、PrimeScript RT－PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、RNAiso－mate for Plant Tissue、RNAiso Plus(Total RNA提取試劑) 大連寶生物。

梯度PCR擴(kuò)增儀C1000 Bio－Rad Laboratory;電泳儀DYY－2 北京市六一儀器廠;Touching 956數(shù)碼相機(jī)凝膠成像系統(tǒng) 上海天呈科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)Neofuge 23R 上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織培養(yǎng)體系的建立

1.2.1.1 無菌外植體的制備 選擇無病斑，籽粒飽滿，顏色均一的紅三葉種籽，脫毒，種籽在自來水下沖洗20min，用75%的乙醇浸泡1min，5%有效氯濃度次氯酸振蕩清洗20min，無菌水沖洗三次，每次不少于兩分鐘，濾紙吸干水分，播種在不添加激素的MS+10g蔗糖+6%瓊脂的培養(yǎng)基上，16h光照，8h黑暗，25℃，培養(yǎng)一周。

1.2.1.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 分離幼苗子葉和下胚軸，將下胚軸切成5mm長(zhǎng)的小段，子葉切成兩瓣，分別接種于MS+20g/L蔗糖+0.6%瓊脂的基本培養(yǎng)基，添加2mg/L 2，4－D，0.5mg/L 6－BA［7］。(25±2)℃，暗培養(yǎng)。每隔一周觀察一次，記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.1.3 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 誘導(dǎo)出的愈傷組織繼代培養(yǎng)條件為，MS+0.5mg/L 6－BA+0.5mg/L 2，4－D，每隔一周觀察并記錄一次。

1.2.2 引物的合成和總RNA的提取 依據(jù)GeneBank的異黃酮合酶序列(AY253284.1)［8］設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen公司合成。

同 源 引 物:IFSHONG1 5'ATGTTGTTAG AAATTGCAGTTGC3';

互補(bǔ)引物:IFSHONG25'TTAAGAGGAAA GGAGTTTAGCTG3';

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織提取總RNA:取繼代一次，生長(zhǎng)穩(wěn)定的岷山紅三葉愈傷組織一塊(約300mg)，在液氮中研磨至粉末狀，加入1mL植物組織RNA提取輔助劑，繼續(xù)研磨至裂解液透明，迅速轉(zhuǎn)入1.5mL Eppendorf管，12000r/min 4℃ 離心5min;小心吸取上清液平均分至2個(gè)新的1.5mL Eppendorf管，各約500μL;各加入500μL的RNAiso Plus振蕩混勻，靜置5min;隨后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，靜置5min;12000r/min 4℃離心15min;吸取上清轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中;加入等體積的異戊醇，上下顛倒混勻后，室溫靜置10min;12000r/min 4℃離心10min;小心棄去上清，沿管壁緩慢加入1mL 75%乙醇，輕輕上下顛倒離心管，12000r/min 4℃離心5min后棄去上清;室溫干燥5min;加入40μL的Rnasefree水溶解。－80℃保存，備用。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄與PCR反應(yīng) 采用兩步RT－PCR法，反轉(zhuǎn)錄:總RNA 1μL，Random 6 mers 1μL，dNTP 1μL和Rnase Free dH2O 7μL，反應(yīng):65℃ 5min，4℃保存;向上述反應(yīng)液添加5×Prime Script Buffer 4μL，Rnase Inhibitor 0.5μL，PrimeScript Rtase 0.5μL，Rnase Free dH2O 5μL，反應(yīng):30℃ 10min，42℃ 20min，75℃ 15min，4℃保存;以岷山紅三葉cDNA為模板，擴(kuò)增IFS基因，PCR反應(yīng)體系包含:10×PCR BufferⅡ2.5μL，dNTP Mixtuer 1μL，IFSHONG1、2各 0.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.25μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2.5μL和Rnase Free dH2O 17.75μL補(bǔ)足25μL;反應(yīng)程序如下: 94℃變性30s;58℃退火30s;72℃延伸90s(10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1℃);94℃變性30s;48℃退火 30s;72℃延伸 90s(25個(gè)循環(huán));72℃終延伸5min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收、克隆與序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收，按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0說明書操作。按PCR產(chǎn)物克隆試劑盒說明將回收片段與pUGM－T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，在添加Amp、IPTG、X－gal的LB平板上挑取白色菌落。提取質(zhì)粒DNA后，經(jīng)限制酶酶切和PCR擴(kuò)增，選擇有正確插入片段的克隆，測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 IFS基因的克隆

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分析表明，擴(kuò)增得到約1.6kb的片段，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要擴(kuò)增的片段大小相符(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物Fig.1 Product of PCR

2.2 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收，與pUGM－T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α后，挑選白色菌落。提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)限制酶酶切和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到約1.6kb片段，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要擴(kuò)增得到的片段大小相符(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒的限制酶切及圖譜Fig.2 Restriction and PCR amplification map of recombination plasmid

2.3 IFS基因的序列比對(duì)分析

克隆產(chǎn)物經(jīng)正反兩向測(cè)序后，拼接結(jié)果表明，IFS基因全長(zhǎng)1575個(gè)堿基，通過Blast與Genbank分析，與已報(bào)道的紅三葉異黃酮合酶基因(AY253284.1)的核苷酸同源性為99%(圖3)。同時(shí)分析結(jié)果表明和其他植物(大豆、蒺藜苜蓿、三野葛、鷹嘴豆等)中異黃酮合酶相比有很高的同源性。氨基酸水平同源性為75%～80%，相似性高達(dá)92%～97%。與白三葉，紫花苜蓿和綠豆等中異黃酮合酶更有高達(dá)95%～99%的同源性(圖4)。系統(tǒng)發(fā)生分析表明紅三葉異黃酮合酶最接近蒺藜苜蓿(圖5)。

圖3 岷山紅三葉IFS序列Fig.3 Sequence of IFS from Trifolium Pratense Minshan

圖4 紅三葉異黃酮合酶氨基酸序列和其他植物異黃酮合酶的多重序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of IFS－Tp and plant IFS proteins

圖5 系統(tǒng)發(fā)生樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of other plant IFS

3 討論與結(jié)論

從第一例轉(zhuǎn)基因煙草的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)飛速發(fā)展，今天它不僅僅是傳統(tǒng)育種的輔助手段，也是植物生物技術(shù)和品質(zhì)改良的核心。由于紅三葉種質(zhì)資源有限，并且與野生型的種質(zhì)具有不相容性［9］，使得利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)紅三葉草進(jìn)行品種改良至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外研究三葉草多側(cè)重于將外源基因?qū)肴~草基因組，而對(duì)三草葉本身具有重要應(yīng)用價(jià)值的基因研究較少。

杜邦公司在2000年首次將大豆IFS基因轉(zhuǎn)入模式生物擬南芥，并在葉片和莖中檢測(cè)到IFS的表達(dá)，染料木素含量是2μg/g［10］。Bong Gyu Kim等［5］將紅三葉IFS基因轉(zhuǎn)化酵母，重組酵母微粒體可以將柚皮素轉(zhuǎn)化為染料木素。紅三葉中IFS基因是單拷貝，如果將克隆的IFS片段通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)回紅三葉基因組，理論上會(huì)提高紅三葉中IFS的拷貝數(shù)，從而提高異黃酮的產(chǎn)量。

本文通過PCR方法，從岷山紅三葉的愈傷組織中克隆了異黃酮合酶基因(IFS)，該基因全長(zhǎng)1575個(gè)核苷酸，編碼525個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的紅三葉異黃酮合酶基因核苷酸同源性99%。該基因的克隆為下一步將IFS基因?qū)爰t三葉，改良紅三葉草種質(zhì)，提高紅三葉的藥用價(jià)值創(chuàng)造了條件，為研究植物異黃酮的生物合成以及進(jìn)行異黃酮生物工程研究奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and sequence analysis of isoflavones synthase gene fromTrifolium Pratense Minshan

HU Huan－h(huán)uan1，LIU Rui2，JI Guo－jie1，LI Wei－dong1，F(xiàn)ENG Hui－gen1，*
(1.Life Science and Technology Department，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China;
2.Sanquan Medical College Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China)

For making good use of the specific biological function of isoflavone.A cDNA fragment from full length IFS gene was amplified by polymerase chain reaction from total RNA of callusTrifolium Pratense Minshan，and it was sequenced after cloned into pGEM－T Easy vectors.A cDNA fragment of 1575bp from full length IFS gene was got.The sequencing results indicated that the cloned fragment of IFS contained 1575 nucleotides，and shared a sequence homology of 99%with that from Genbank accession.

Trifolium Pratense Minshan;isoflavone synthase;gene cloning;sequence analysis

Q943.2

A

1002－0306(2012)21－0178－03

2012－04－18 *通訊聯(lián)系人

胡煥煥(1987－)，女，碩士研究生，研究方向:生物制藥。

河南省科技廳重點(diǎn)支持項(xiàng)目(102102310189);河南省教育廳立項(xiàng)項(xiàng)目(2009A180014);新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新支持項(xiàng)目(YJSCX201116Y)。