落新婦甙對(duì)大鼠心臟移植細(xì)胞凋亡的作用

王瀟 陳濤 潘鐵成

器官移植術(shù)后，如何有效地抑制排斥反應(yīng)一直是個(gè)難題，眾多研究顯示，T淋巴細(xì)胞在器官移植急性排斥反應(yīng)中起核心作用，介導(dǎo)移植物損傷的效應(yīng)細(xì)胞主要是細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)，其作用機(jī)制包括Fas/FasL系統(tǒng)和顆粒酶/穿孔素系統(tǒng)［1］。此外腫瘤壞死因子受體1(TNF-R1)和2(TNF-R2)基因也是重要的凋亡相關(guān)基因［2］。目前已有多種藥物通過對(duì)T細(xì)胞的影響而發(fā)揮免疫抑制作用，最新文獻(xiàn)報(bào)道中藥落新婦甙(Astilbin)能使由植物血凝素激活的T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡［3］，并且能使肝炎動(dòng)物肝臟周圍浸潤的活化T細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而保護(hù)肝臟免受損害［4-5］。落新婦甙是從我國傳統(tǒng)中藥土茯苓中提取的單體成分，具有多種藥理作用。那么，落新婦甙對(duì)移植排斥反應(yīng)中活化T淋巴細(xì)胞是否也有促凋亡作用，能否抑制移植排斥反應(yīng)是值得探討的課題。以往研究均為體外實(shí)驗(yàn)，而器官移植后給予落新婦甙，移植器官會(huì)有何變化尚未見報(bào)道。本研究旨在通過建立大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型，并于術(shù)后給予落新婦甙，觀察移植心臟存活時(shí)間及心肌細(xì)胞凋亡情況的變化，探討落新婦甙對(duì)大鼠心臟移植排斥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 大鼠心臟移植及取材

采用華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的健康、清潔級(jí)、近交系、封閉群雄性Wistar大鼠和遠(yuǎn)交群(Sprague Dawley，SD)大鼠各 36只，體質(zhì)量200～250 g。以 Wistar大鼠為受體，SD大鼠為供體，按照Chen［6］的方法進(jìn)行頸部異位心臟移植。

1.1.1 供心切取 SD大鼠1%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.3 ml/100 g體質(zhì)量)麻醉后固定。正中切開胸腹部皮膚，暴露胸骨，沿腹白線正中縱行開腹，推開腸管暴露下腔靜脈，緩慢推注肝素生理鹽水2 ml，3 min后剪開膈肌并沿雙側(cè)腋前線剪開至鎖骨下緣，將胸壁翻起。剪開心包暴露心臟，以冰屑覆蓋心臟，分離下腔靜脈及右上腔靜脈，以5-0絲線緊貼心房結(jié)扎并剪斷，將右心耳結(jié)扎［7］。去除胸腺，游離升主動(dòng)脈及無名動(dòng)脈，在無名動(dòng)脈與左頸總動(dòng)脈之間結(jié)扎主動(dòng)脈弓，再結(jié)扎遠(yuǎn)端將主動(dòng)脈弓切斷，將殘端留長(zhǎng)些以免絲線脫落，留無名動(dòng)脈大約2～3 mm用來吻合。將顯微鑷插入心包橫竇并擴(kuò)張，可顯露主肺動(dòng)脈直至左右肺動(dòng)脈分叉處，緊靠肺動(dòng)脈分叉起始部剪斷主肺動(dòng)脈。注意將主動(dòng)脈與肺動(dòng)脈之間充分游離。提起心臟，以絲線將左上腔靜脈及全部肺靜脈一次性集束結(jié)扎、切斷，取出心臟放入4℃肝素生理鹽水中保存。

1.1.2 受體準(zhǔn)備 Wistar大鼠麻醉固定后，自下頜骨下方至鎖骨中線上緣，作一斜形切口，在10倍顯微鏡下，顯露右頸外靜脈至其第1屬支處，結(jié)扎切斷胸鎖乳突肌，游離右頸總動(dòng)脈至頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處。

1.1.3 心臟移植 在受體Wistar大鼠的右頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端分叉處結(jié)扎頸總動(dòng)脈。小血管夾夾閉近心端。在結(jié)扎線與血管夾間，切斷頸總動(dòng)脈。在頸外靜脈近鎖骨上緣處小血管夾夾閉，于第1個(gè)屬支處結(jié)扎，近心端切斷頸外靜脈。生理鹽水沖洗動(dòng)、靜脈腔后，將SD大鼠的供心置于切口內(nèi)，在16倍顯微鏡下行供心無名動(dòng)脈與受體右頸總動(dòng)脈端端連續(xù)吻合、供心主肺動(dòng)脈與受體頸外靜脈端端連續(xù)吻合。在進(jìn)行吻合時(shí)用蘸冷生理鹽水溶液的小棉紗布覆于供心表面，以防復(fù)溫。將干小棉球覆于吻合周圍。先放開頸外靜脈小血管夾，再放開頸總動(dòng)脈小血管夾。移植心臟復(fù)跳后，待吻合口不出血時(shí)，取出小棉球。仔細(xì)放好移植心臟位置，關(guān)閉皮膚切口。

1.1.4 術(shù)后處理 術(shù)后肌注青霉素500 U/10 g體質(zhì)量，用燈泡照射保溫，大鼠在手術(shù)后1～2 h即可清醒，醒后雙眼充血，能爬行、飲水。術(shù)后每日觸摸頸部觀察移植心臟的搏動(dòng)情況。一般移植心臟搏動(dòng)有力，200～300次/min，移植心臟搏動(dòng)24 h以上標(biāo)志移植成功。

術(shù)后將Wistar大鼠按手術(shù)先后順序標(biāo)為1～36號(hào)，完全隨機(jī)法分為兩組，每組18只。灌胃給藥1次/d，對(duì)照組給予生理鹽水1 ml，落新婦甙組給予落新婦甙 1 mg·kg－1·d－1。分別于術(shù)后第 3、5 和 7 天處死Wistar大鼠，摘取移植心臟左心室壁組織，中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚4 μm。

1.2 急性排斥反應(yīng)的診斷

各標(biāo)本切片作常規(guī)蘇木精-伊紅 (HE)染色，顯微鏡觀察，根據(jù)Stanford標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)診斷和分級(jí)［8］。(1)0級(jí):無排斥，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為0;(2)Ⅰ級(jí)ⅠA:有個(gè)別淋巴細(xì)胞浸潤，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為1.0;Ⅰ級(jí)ⅠB:有少量散在的淋巴細(xì)胞浸潤，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為1.5;(3)Ⅱ級(jí):有單灶性侵襲性淋巴細(xì)胞浸潤或伴有灶性心肌細(xì)胞損害，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為2.0;(4)Ⅲ級(jí)ⅢA:有多灶性侵襲性淋巴細(xì)胞浸潤或伴有心肌細(xì)胞損害，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為3.0;Ⅲ級(jí)ⅢB:有彌漫性炎癥并伴有心肌壞死，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為3.5;(5)Ⅳ級(jí):有彌漫性多種類型細(xì)胞的浸潤并伴有出血、水腫和壞死，對(duì)應(yīng)組織學(xué)分級(jí)量化值為4.0。

1.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Apoptosis Detection kitⅠ，POD)，購自武漢博士德公司，其中主要試劑來源為末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)，美國Promega公司;地高辛標(biāo)記的三磷酸脫氧尿苷(DIG-dUTP)，德國 Bochringe Mannheim公司，蛋白酶K、生物素標(biāo)記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)，美國Sigma公司。

方法:各標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟入水，體積分?jǐn)?shù)為3%的新鮮H2O2處理，蒸餾水洗滌;加Tris緩沖鹽溶液(TBS)1∶100稀釋蛋白酶 K，37℃ 10 min，蒸餾水洗;加含TdT和 DIG-dUTP的標(biāo)記緩沖液20 μl，37℃ 2 h，TBS 洗滌;加封閉液50 μl，室溫30 min，甩干;加封閉液 1∶100 稀釋的 Anti-DIG-Biotin 50 μl，37℃ 30 min，TBS洗滌;加 TBS 1∶100稀釋的鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)，37℃ 30 min，TBS洗滌;DAB顯色20 min，蒸餾水洗;蘇木素復(fù)染，TBS洗滌;脫水透明，封片［9］。顯微鏡觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，每例切片計(jì)算出隨機(jī)10個(gè)200倍視野中平均凋亡細(xì)胞數(shù)作為該例的凋亡指數(shù)(AI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 移植心臟急性排斥的病理變化

術(shù)后觀察期內(nèi)所有移植心臟存活良好，無停搏發(fā)生。切片HE染色顯微鏡觀察:對(duì)照組術(shù)后第3天心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常，間質(zhì)內(nèi)有少數(shù)單個(gè)核細(xì)胞浸潤;術(shù)后第5天出現(xiàn)灶性心肌壞死，間質(zhì)水腫，并有散在淋巴細(xì)胞、中性白細(xì)胞浸潤;第7天表現(xiàn)為彌漫性多類型細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫伴心肌纖維素樣壞死。與落新婦甙組比較，同一時(shí)間內(nèi)后者發(fā)生的炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，心肌組織的水腫及壞死顯著減輕。急性排斥的病理分級(jí)比較見表1，兩組組織學(xué)分級(jí)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

表1 術(shù)后不同時(shí)間大鼠移植心臟急性排斥的組織學(xué)分級(jí)()

表1 術(shù)后不同時(shí)間大鼠移植心臟急性排斥的組織學(xué)分級(jí)()

注:與對(duì)照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別 大鼠(只) 第3天 第5天 第7天對(duì)照組6 0.77±0.31 1.99±0.62 3.44±0.54落新婦甙組 6 0.37±0.42a 0.88±0.20b 1.04±0.33b

2.2 急性排斥與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

原位末端標(biāo)記(TUNEL)切片觀察可見移植心臟的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象存在于排斥反應(yīng)的整個(gè)過程，凋亡的細(xì)胞主要是心肌細(xì)胞，少數(shù)為浸潤的淋巴細(xì)胞(圖1)。

圖1 兩組術(shù)后第7天TUNEL切片觀察(蘇木素染色，×200)

隨著急性排斥的加劇，凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)率增加，而術(shù)后落新婦甙的應(yīng)用明顯減少了心肌細(xì)胞的凋亡發(fā)生。兩組移植心臟的AI見表2，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 術(shù)后不同時(shí)間大鼠移植心臟的AI水平()

表2 術(shù)后不同時(shí)間大鼠移植心臟的AI水平()

注:與對(duì)照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

組別 大鼠(只) 第3天 第5天 第7天6 4.03±1.32 8.52±1.97 9.73±6.21落新婦甙組 6 0.87±1.11a 2.53±2.49b 4.71±2.99對(duì)照組b

3 討論

本研究顯示，細(xì)胞凋亡存在于急性排斥的整個(gè)過程，并且隨著排斥程度的加劇而增加，表明細(xì)胞凋亡亦參與了心臟移植排斥反應(yīng)，是心臟移植急性排斥中細(xì)胞死亡的重要機(jī)制。

而落新婦甙能明顯減少移植心臟組織中炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕急性排斥和移植物損傷，尤其在排斥反應(yīng)較為嚴(yán)重的第5天和第7天效果最為突出。有研究顯示，落新婦甙能明顯減少移植心細(xì)胞凋亡的發(fā)生，落新婦甙對(duì)移植物的保護(hù)可能是通過抑制移植物細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的［10］。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，為遺傳決定的復(fù)雜分子過程［11］，包括3個(gè)基本時(shí)相:啟動(dòng)相是接受了體內(nèi)外指令性凋亡信息分子或信號(hào)的觸發(fā)誘導(dǎo)，效應(yīng)相則是很多促凋亡和抗凋亡基因以相互促進(jìn)和相互制約的形式，組成一個(gè)完整的細(xì)胞凋亡系統(tǒng)并保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦失去平衡則進(jìn)入清除降解相［12］。其中，F(xiàn)as、Fas、TNF-R1 和 TNF-R2 基因是重要的凋亡相關(guān)基因［13］。

在急性移植排斥反應(yīng)中，介導(dǎo)移植物損傷的效應(yīng)細(xì)胞主要是CTL，其作用機(jī)制包括Fas/FasL系統(tǒng)和顆粒酶/穿孔素系統(tǒng)。CTL經(jīng)移植抗原激活后表達(dá)FasL，與靶細(xì)胞表面的Fas結(jié)合可激活凋亡效應(yīng)分子 caspases(一群含半胱氨酸蛋白酶)［14］;同時(shí)CTL釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在靶細(xì)胞上形成跨膜的管狀結(jié)構(gòu)，顆粒酶由此進(jìn)入靶細(xì)胞，通過蛋白水解亦可激活 caspases，從而啟動(dòng)靶細(xì)胞凋亡［15］。其中CD+CTL采用Fas和穿孔素等方式，CD4+CTL主要采用Fas/FasL系統(tǒng)殺傷靶細(xì)胞［16］。

目前落新婦甙免疫抑制作用的確切機(jī)制尚未完全清楚，落新婦甙是從傳統(tǒng)中藥土茯苓中提取的單體成分，有研究表明其可能通過增強(qiáng)促凋亡基因FasL、TNF-R1表達(dá)，抑制抗凋亡基因 TNF-R2表達(dá)［17］，同時(shí)增強(qiáng)同種反應(yīng)性T細(xì)胞Bax和Caspase-3的表達(dá)，降低Bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)活化的T淋巴細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗排斥反應(yīng)作用［18］，落新婦甙的作用機(jī)制是多方面的，抑制移植物細(xì)胞的凋亡可能是它發(fā)揮免疫抑制作用的重要機(jī)制。

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