燙傷油質(zhì)量標準研究

王淑華，林永強，徐麗華

(1.山東省生物藥物研究院，山東濟南250101;2.山東省食品藥品檢驗所，山東濟南250101)

燙傷油是根據(jù)中醫(yī)臨床驗方研制，由馬尾連、紫草、黃芩、地榆、大黃和冰片(合成龍腦)6味中藥組成的復方制劑，具有清熱解毒，涼血祛腐止痛的功效。1970年批準生產(chǎn)，后陸續(xù)收載于《山東省藥品標準》1986年版［1］和《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準—中藥成方制劑(第二冊)》，標準僅有制法、性狀和異物檢查項［2］?？煽仨椖枯^少，為確保制劑質(zhì)量，對質(zhì)量標準進行了系統(tǒng)全面的研究，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 6890氣相色譜儀;Sartorius CP225D電子天平。

1.2 試藥 對照品及對照藥材均由中國藥品生物制品檢定所提供，批號分別為:紫草:110736－200525;黃芩素:111595－200905;大黃素甲醚:110758－200611;大黃酚:110796－200716;冰片:110743－200504;水楊酸甲酯:707－200107。樣品:3家生產(chǎn)企業(yè)的10批燙傷油批號見表2。氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷和乙酸乙酯等均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

本品輔料為麻油，按傳統(tǒng)方法用甲醇、乙醇、三氯甲烷等溶劑提取時，均會溶解大量的麻油，很難去除，影響了薄層效果。由于紫草的主要成分為萘醌類化合物，黃芩所含的主要成分黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等均為黃酮類化合物，大黃所含的大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等均為蒽醌類化合物，這三類化合物均有一共同的特點:含多個酚羥基，具一定的酸性。因此可用酸堿處理的方法同時從燙傷油中提取紫草、黃芩和大黃三種藥材的多酚羥基成分，再用三氯甲烷提取酸性水溶液，即可得到供試品溶液。

2.1 紫草的薄層色譜鑒別 取本品20 g，用2%氫氧化鈉溶液20 mL振搖提取，提取液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至酸性，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取紫草對照藥材0.5 g，用麻油13 g浸泡24 h后炸至枯黃，濾過，同供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。同時取處方中除去紫草的其他藥味，按處方比例制成陰性對照樣品，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。氨蒸氣中熏至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 紫草鑒別的薄層色譜圖

2.2 黃芩的薄層色譜鑒別 黃芩所含的黃酮類主要化合物黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等均為多酚羥基化合物，顯酸性，故采用紫草鑒別中的供試品溶液。取黃芩素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。同時取處方中除去黃芩的其他藥味，按處方比例制成缺黃芩的陰性對照樣品。取陰性對照樣品約20 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(10∶3∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5% 三氯化鐵乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

2.3 大黃的薄層色譜鑒別 大黃所含大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等均為酚羥基蒽醌衍生物，顯酸性，故也可采用紫草鑒別中的供試品溶液。取大黃素甲醚和大黃酚對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL各含0.5mg的混合溶液，作為對照品溶液。同時取處方中除去大黃的其他藥味，按處方比例制成缺大黃的陰性對照樣品。取陰性對照樣品約20 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取供試品溶液10 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。置氨蒸氣中熏至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

圖2 黃芩鑒別的薄層色譜圖

圖3 大黃鑒別的薄層色譜圖

3 含量測定

處方中的馬尾連、大黃、紫草、地榆、黃芩均使用油炸提取，常用的指標成分大黃素、左旋紫草素和黃芩苷等已發(fā)生部分轉(zhuǎn)化［3］，因此選擇處方中具有清熱止痛作用的冰片為含量測定指標，用水楊酸甲酯為內(nèi)標的毛細管氣相色譜法進行測定。

3.1 色譜條件 彈性石英毛細管柱(柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度 0.25 μm)HP －FFAP;程序升溫:初始溫度 130℃，保持15 min，以每分鐘30℃的速率升溫至200℃，保持5 min;檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，檢測器溫度為300℃;進樣口溫度為210℃;恒壓11.47 PSi;分流比10∶1;進樣量 1 μL。

3.2 對照品溶液的制備 精密稱取冰片對照品20.36 mg，加乙酸乙酯溶解并稀釋至50 mL，作為對照品儲備液(濃度為:0.407 2 mg·mL－1)。精密稱取水楊酸甲酯 86.18 mg，加乙酸乙酯稀釋至100 mL，作為內(nèi)標溶液(濃度為:0.861 8 mg·mL－1)。精密量取對照品儲備液5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液2 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品0.5 g，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液2 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.4 線性范圍 分別精密吸取3.2項下對照品儲備液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置 10 mL 量瓶中，分別加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀測定。以對照品的進樣量為橫坐標，異龍腦和龍腦的峰面積之和為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=1 680.044 2 X+12.219 6，相關(guān)系數(shù) r=0.999 5。結(jié)果表明，冰片進樣量在0.081 44～0.407 2 μg之間與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

3.5 儀器精密度試驗 取3.2項下的對照品溶液按確定的色譜條件，連續(xù)進樣6次，以冰片中龍腦和異龍腦的總面積計算平均校正因子及RSD，計算公式:校正因子(AS:內(nèi)標物峰面積;CS:內(nèi)標物濃度;AR:對照品峰面積;CR:對照品濃度)結(jié)果平均校正因子 f值為0.684 6，RSD為0.29%。結(jié)果表明本方法精密性良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，每隔2 h進樣一次，每次1 μL，共考察8 h，測定各異龍腦與龍腦的峰面積之和與水楊酸甲酯峰面積的比值，以觀察樣品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性。結(jié)果表明供試液在8 h內(nèi)異龍腦與龍腦的峰面積之和與水楊酸甲酯峰面積的比值RSD為0.69%，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 重復性試驗 取燙傷油(廣西 批號080304)按照供試品溶液的制備方法，平行制備6份樣品，按上述方法和條件進行測定，計算每份供試品的含量。結(jié)果平均含量為3.2 mg·g－1，RSD為1.2%，說明本品含量測定方法的重復性良好。

3.8 加樣回收率 精密稱取已知含量為3.2 mg·g－1的樣品(廣西 批號080304)0.25 g，共6份，每份分別加入濃度為0.412 8 mg·mL－1的冰片對照品溶液2 mL，內(nèi)標溶液2 mL，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，吸取1 μL，注入氣相色譜儀，分別計算加樣回收率。結(jié)果見表1，表明測定方法的回收率良好。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

3.9 空白試驗 取處方中除去冰片的其他藥味，按處方比例制成缺冰片的陰性對照樣品。取陰性對照樣品約0.5 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

分別精密吸取上述內(nèi)標溶液、對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進行測定。結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜和內(nèi)標物質(zhì)水楊酸甲酯保留時間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，而陰性對照色譜中無相應(yīng)色譜峰。說明處方中其他藥味對測定結(jié)果無干擾，見圖4。

圖4 空白試驗GC色譜圖

3.10 樣品測定 按本文建立的方法分別測定了三家企業(yè)10批樣品的含量(n=2)，測定結(jié)果見表2。

表2 10批樣品中冰片含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 薄層鑒別制備供試品溶液時，曾采用乙醇萃取法［4］。但試驗中發(fā)現(xiàn)乙醇萃取液濃縮后仍有大量麻油，無法進一步精制，提取特征成分。通過研究發(fā)現(xiàn)紫草、黃芩和大黃所含的特征成分均為多酚羥基化合物，具一定的酸性。因此采用酸堿水溶液處理方法既能很好地從麻油中提取特征成分，又能同時提取紫草、黃芩和大黃三味藥材中的多酚羥基成分，實現(xiàn)一個供試品溶液供多味藥材鑒別的目的，為同類劑型的質(zhì)量分析提供參考。

4.2 紫草的薄層色譜鑒別方法建立時曾嘗試以紫草對照藥材和左旋紫草素對照品為對照進行試驗，結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，未見相同顏色的斑點。由于制備工藝中經(jīng)過油炸工序，紫草所含的萘醌類化合物可能轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。故將紫草對照藥材同樣通過油炸后，提取制備對照藥材溶液，結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。黃芩的薄層色譜鑒別方法曾嘗試以黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素為對照進行試驗，結(jié)果供試品色譜中未檢出黃芩苷，可能是黃芩苷遇高溫被破壞，檢出黃芩素和漢黃芩素，但漢黃芩素斑點不清晰，故最終選擇黃芩素作對照。

4.3 本試驗還對燙傷油的色譜條件進行了最優(yōu)條件的選擇，考察了不同的色譜柱:Agilent HP－FFAP、Agilent Innowax和Agilent DB－1701，結(jié)果三種色譜柱測定冰片，對稱因子、分離度和理論板數(shù)等均符合要求［5］，選擇該色譜條件測定冰片，對色譜柱選擇性不強，適用范圍廣。還比較了不同的柱溫:110℃恒溫測定，各成分峰都達到較好的分離，但由于保留時間較長，影響峰形;150℃恒溫測定，異龍腦和龍腦的分離度達不到要求;130℃恒溫測定，各成分峰都達到較好的分離，且峰形較好，但供試品色譜中，待測成分檢出后，仍有雜質(zhì)峰出現(xiàn)。為了避免雜質(zhì)峰影響及節(jié)約分析時間，最終選擇3.1項下的色譜條件。由表2測定結(jié)果可以看出，三家企業(yè)十批樣品的含量從1.2到6.1 mg·g－1，差異達5倍。說明由于原質(zhì)量標準未對冰片進行質(zhì)量控制，企業(yè)產(chǎn)品批間均一性較差。因此，通過對燙傷油中冰片質(zhì)量分析方法的建立，可有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

［1］山東省衛(wèi)生廳.山東省藥品標準［S］.濟南:山東省衛(wèi)生廳，1986.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑(第二冊)［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1990.

［3］葉勇，潘渭樵.溫度對紫草素及其衍生物穩(wěn)定性的影響［J］.中國藥物與臨床，2007，7(7):540 －541.

［4］陳晶，馬學禮，何艷萍.復方紫草油質(zhì)量控制方法的研究［J］.寧夏醫(yī)學雜志2007，29(12):1147.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄38.