HPLC法測(cè)定松花粉中山柰酚的含量

王 正，顧 蓉，朱彩芳，酈紅巖

(江蘇吉貝爾藥業(yè)有限公司，江蘇鎮(zhèn)江212009)

松花粉是松科植物馬尾松(Pinus massoniana Lamb.)、油松(Pinus tabuliformis Carr.)或同屬數(shù)種植物的干燥花粉，具有收斂止血，燥濕斂瘡的功效，用于外傷出血、濕疹、黃水瘡、皮膚糜爛、膿水淋漓［1］。目前國(guó)家衛(wèi)生部已確認(rèn)松花粉為新資源食品，并列為普通食品管理。

松花粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素、糖類等物質(zhì)，現(xiàn)代研究大多側(cè)重于松花粉中氨基酸、微量元素的檢測(cè)［2］，對(duì)其中的生物活性物質(zhì)黃酮類成分的研究報(bào)道很少。唐雨［3］等研究發(fā)現(xiàn)松花粉中含有山柰酚等黃酮類化合物，但對(duì)其黃酮類化合物具體成分的定量研究報(bào)道很少，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)［4～6］，對(duì)其所含的山柰酚進(jìn)行了含量測(cè)定，提供了對(duì)松花粉進(jìn)行質(zhì)量控制的方法和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC－10A高效液相色譜儀，LC－10ATVP泵，SPD－10AVP可見(jiàn)紫外檢測(cè)器;浙大智達(dá)N2000雙通道色譜工作站;Satorius CP225D電子天平;HH恒溫水浴鍋(金壇中大儀器廠)。

1.2 試藥 山柰酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110861－200808，供含量測(cè)定用)，甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。樣品購(gòu)自云南，經(jīng)江蘇大學(xué)歐陽(yáng)臻教授鑒定為松花粉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.4% 磷酸溶液(65∶35);流速:1.0 mL·min－1;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣 20 μL。理論板數(shù)按山柰酚峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取山柰酚對(duì)照品適量，加80%甲醇制成每1 mL含25 μg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加80%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取一定量的山柰酚對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為 248.7 μg·mL－1)，加 80%甲醇制成濃度為 6.220、12.435、24.870、49.740、99.480 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為 Y=16.663X －0.035 6，r=0.999 7，結(jié)果表明山柰酚在 0.124 4 ～1.989 6 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為1.68%，表明其精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品供試液，分別在0、2、4、6、8 h測(cè)定山柰酚峰面積，其RSD為1.05%，表明樣品在8 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批樣品6份，依法處理，測(cè)定，結(jié)果樣品中山柰酚的平均含量為2.767 mg·g－1，RSD 為1.23%。

圖1 HPLC圖

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品共9份(約0.25 g)，每3份一組，分別精密加入山柰酚對(duì)照品溶液(濃度為0.149 2 mg·mL－1)4、5、6 mL，按供試品溶液制備方法制備，得供試品溶液。依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取不同批次的松花粉樣品，按供試品溶液制備方法制備，如法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 選擇甲醇－0.4%磷酸溶液體系，改變流動(dòng)相的比例，通過(guò)試驗(yàn)摸索，甲醇－0.4%磷酸溶液比例在65∶35時(shí)，目標(biāo)指標(biāo)能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，且其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3.2 樣品提取條件的選擇 在研究過(guò)程中分別進(jìn)行了不同濃度的甲醇提取、不同提取方法(加熱回流、超聲提取)和不同提取時(shí)間(0.5、1、1.5 h)的比較，最后確定以 80%甲醇回流1 h。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:191－192.

［2］王敏.松花粉的成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12(4):357 －359.

［3］唐雨，張瑜，袁久志，等.松花粉化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28(6):429 －432.

［4］陳勇，鄒親朋，劉向前，等.RP－HPLC測(cè)定糙葉五加不同藥用部位中槲皮素和山柰酚［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(4):310 －312.

［5］于雷，嚴(yán)銘銘，楊智，等.HPLC同時(shí)測(cè)定蚊子草藥材中槲皮苷，山柰酚含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(14):1985－1987.

［6］李忠，王曉麗.RP－HPLC法測(cè)定北柴胡地上部分山柰酚的含量［J］.中國(guó)野生植物資源，2006，25(6):61－62.