DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

張曉峰，劉福艷

(1.山東大學(xué)管理學(xué)院，山東濟(jì)南250100;2.山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)南250101)

1985年，英國(guó)科學(xué)家杰佛雷斯(Jeffreys)利用人類微小衛(wèi)星區(qū)的DNA進(jìn)行了生物個(gè)體與種屬的鑒別，并首次把這一技術(shù)稱之為DNA指紋(DNA fingerprinting)圖譜技術(shù)［1］。眾所周知，絕大多數(shù)的中藥材都是植物體、動(dòng)物體和菌物體，而一切生命體都可以從基因水平或者說(shuō)DNA水平上進(jìn)行刻劃，因此，DNA分子水平上的指紋最能從本質(zhì)上表征中藥材自身特征。DNA指紋圖譜技術(shù)是一種在分子水平上、以藥材基因型特征為鑒定指標(biāo)的新技術(shù)，它直接分析遺傳物質(zhì)DNA本身，是分析生物的基因型而非表現(xiàn)型，排除了環(huán)境因素給藥材鑒定帶來(lái)的干擾，也不受樣品形態(tài)(藥材原植物、飲片或粉末)和材料來(lái)源的影響，比傳統(tǒng)的方法(性狀、顯微、理化鑒定)更準(zhǔn)確可靠，它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種)，而且可以檢測(cè)外形極為相似的同種不同變種、變型、品系、化學(xué)型乃至個(gè)體之間的DNA的細(xì)微變異。這一技術(shù)近年來(lái)正越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于中藥研究中［2］。本文結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，綜述了DNA指紋圖譜的概念、原理、發(fā)展歷程及近年來(lái)在中藥質(zhì)量研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展情況，為相關(guān)研究提供參考。

1 DNA指紋圖譜的概念與原理

DNA指紋圖譜技術(shù)是將個(gè)體的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶消化，分離得到不同大小的DNA片段，再以重復(fù)序列中的共有序列作為核酸探針進(jìn)行雜交，對(duì)所得到不同生物個(gè)體相似DNA片段的帶型圖譜(即DNA指紋圖譜，對(duì)每一個(gè)體都是獨(dú)特的)進(jìn)行分析的方法。該技術(shù)能揭示并比較生物個(gè)體間關(guān)系的密切程度，有效地應(yīng)用于遺傳分析、種質(zhì)鑒定等方面。不同種生物體含有不同的DNA序列，同種生物體既有相同的DNA序列，保持同種生物體的遺傳性狀，又具有多態(tài)性，這種多態(tài)性可以是個(gè)體、種屬或變異等引起的，它使得同種生物中的各個(gè)體千差萬(wàn)別，生物多樣性正是由于其基因多態(tài)性的結(jié)果。在分子水平上檢測(cè)基因多態(tài)性，比形態(tài)、組織和化學(xué)水平上檢測(cè)更能代表其變異類的遺傳標(biāo)記，其鑒別結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。DNA指紋技術(shù)靈敏度高，如果選擇合適的擴(kuò)增引物，其結(jié)果的重復(fù)性也非常好［2］。

2 DNA指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展歷程

DNA指紋研究始于二十世紀(jì)八十年代初期，是一種稱作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(英文縮寫(xiě)RFLP)［3］的標(biāo)記技術(shù)。在細(xì)胞中有一種特殊的酶——限制性核酸內(nèi)切酶，它可以把DNA切割成長(zhǎng)度不同的片段。這種酶有一個(gè)特點(diǎn)，就是它只能在DNA的特定位點(diǎn)上進(jìn)行切割，而且，只能識(shí)別這些特異的位點(diǎn)。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，不同種屬的生物體中DNA上的這些限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)是各不相同的，因此，當(dāng)用一種限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)某種生物體DNA進(jìn)行切割時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不同的酶切片段，形成該種生物特異的DNA指紋圖譜，這種指紋圖譜就叫做RFLP圖譜。不同種生物的RFLP圖譜是不同的，因此，根據(jù)RFLP圖譜就可以進(jìn)行中藥材的品種鑒定。RFLP技術(shù)是發(fā)展最早的DNA指紋標(biāo)記技術(shù)，其缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用不便，價(jià)格昂貴。

1985年，美國(guó)科學(xué)家穆里斯(Mullis)發(fā)明了一種稱之為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的技術(shù)［4～6］。這種技術(shù)是先人工合成一對(duì)幾個(gè)至十幾個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸引物，利用這對(duì)引物和DNA聚合酶，在有四種脫氧單核苷酸存在的條件下，就可以將要擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行指數(shù)倍地?cái)U(kuò)增，而這一切只在試管中就可以完成。

在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，1990年，威利姆斯(Williams)發(fā)明了另一種新的DNA指紋圖譜技術(shù)——隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(英文縮寫(xiě)RAPD)技術(shù)［7］。與PCR技術(shù)中合成一對(duì)引物不同的是，在RAPD技術(shù)中，是合成一系列9－10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸排列順序隨機(jī)的單鏈引物，然后，用這些引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于不同種屬生物可擴(kuò)增出的DNA片段與長(zhǎng)度的不同，就可以形成代表這種生物自身特征的指紋圖譜，從而可以進(jìn)行生物物種的鑒定。因此，RAPD技術(shù)廣泛用于中藥DNA指紋圖譜的構(gòu)建，在目前絕大多數(shù)藥用動(dòng)植物DNA序列還未知的情況下，RAPD技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。PCR技術(shù)的誕生使目的基因極易獲得，再與RFLP聯(lián)用，還產(chǎn)生了PCR－RFLP、RAPD－RFLP等方法。

20世紀(jì)90年代荷蘭科學(xué)家Pieter Vos［8］等發(fā)明、發(fā)展了高效檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法，稱為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA(Ampli－ fied Fragment Length Polymorphism，AFLP)。AFLP是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記，與RFLP、RAPD比較，AFLP法構(gòu)建的DNA指紋圖譜在操作前不需要提供序列信息，而且具有效率高、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，其所檢測(cè)到的大多數(shù)擴(kuò)增片斷與基因組的單一位置對(duì)應(yīng)，顯示了AFLP技術(shù)特別適合中藥品種鑒定的應(yīng)用價(jià)值和廣闊前景。

SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一類由幾個(gè)核苷酸(一般為1～6個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。在真核生物中，存在許多2～5 bp簡(jiǎn)單重復(fù)序列，稱為“微衛(wèi)星DNA”，其兩端的序列高度保守，可設(shè)計(jì)雙引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，揭示其多態(tài)性。SSR具有以下一些優(yōu)點(diǎn):①一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn);②微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子;③所需DNA量少。

ISSR(inter－ simple sequence repeat)是 Zietkeiwitcz［9］等于1994年發(fā)展起來(lái)的又一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記。ISSR引物的開(kāi)發(fā)不像SSR引物那樣需測(cè)序獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，開(kāi)發(fā)費(fèi)用降低。與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標(biāo)記一樣具有較強(qiáng)的種特異性;與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測(cè)非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記。目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。

3 DNA指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，中醫(yī)藥工作者將DNA指紋圖譜技術(shù)引入到自己的研究領(lǐng)域，并取得了令人矚目的成果，對(duì)中醫(yī)藥學(xué)的現(xiàn)代化進(jìn)程產(chǎn)生了積極的推動(dòng)作用。

3.1 名貴中藥材鑒定、道地性研究 中藥材真?zhèn)舞b別及道地品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用最多的一個(gè)領(lǐng)域。隨著摻偽技巧越來(lái)越高，有時(shí)單憑傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別方法已難以辨別真?zhèn)?，常?guī)理化鑒別又存在著用樣量大，操作復(fù)雜，專屬性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。DNA指紋圖譜技術(shù)以其取樣量小、減少貴重樣品損消耗、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏性高等特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視，近年來(lái)成為中藥材鑒定的重要研究手段。中藥材的質(zhì)量除了與藥材特定的生長(zhǎng)環(huán)境和特殊的采收加工技術(shù)有關(guān)外，還與該藥材產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關(guān)，這就是藥材的“道地性”。但以前對(duì)道地藥材“道地性”的研究?jī)H限于化學(xué)、藥理學(xué)方面。通過(guò)DNA指紋標(biāo)記技術(shù)和化學(xué)、藥理學(xué)手段結(jié)合對(duì)道地藥材進(jìn)行研究，并進(jìn)一步對(duì)遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關(guān)系進(jìn)行研究，能更好地對(duì)道地藥材、名優(yōu)藥材進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)。表1列舉了DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥鑒定分析及道地性鑒別中的部分應(yīng)用。

表1 DNA指紋圖譜技術(shù)中藥遺傳分析及鑒定中的部分應(yīng)用實(shí)例

3.2 藥種質(zhì)資源的研究和遺傳育種 藥用植物種質(zhì)資源是一切可用于藥物開(kāi)發(fā)的植物遺傳資源，是所有藥用植物物種資源的總和。種質(zhì)資源是基因的載體，植物種內(nèi)所有個(gè)體及遺傳性狀的基因構(gòu)成了該物種的種質(zhì)資源。對(duì)于遺傳多樣性水平較低的品種，應(yīng)盡可能獲得更多的變異類型，可在自然界中尋找、收集變異植株，或通過(guò)分子生物技術(shù)手段增加其自然變異率，如體細(xì)胞克隆變異、γ或UV射線致突變、原生質(zhì)體培養(yǎng)等方法。DNA指紋技術(shù)可用于藥材個(gè)體或群體的變異觀察。分析這些變異類型的遺傳分化程度及遺傳多樣性水平，對(duì)藥材的選種有重要意義［2］。通過(guò)DNA指紋技術(shù)分析藥材不同品種的遺傳關(guān)系及其差異性，在探明物種遺傳背景和親緣關(guān)系的基礎(chǔ)上，為中藥材物種資源的分析和評(píng)價(jià)及藥效學(xué)相關(guān)基因和抗病基因的定位提供重要信息，推動(dòng)藥材遺傳育種的進(jìn)程，同時(shí)為今后分離有價(jià)值的藥用動(dòng)植物目的基因打好基礎(chǔ)，并為構(gòu)建藥用動(dòng)植物基因庫(kù)提供資料。王志安［25，26］等通過(guò)采取及栽培中藥材白術(shù)樣品，采用AFLP指紋分析技術(shù)，獲得了3 003條白術(shù)的多態(tài)性擴(kuò)增條帶，建立了中藥白術(shù)種質(zhì)的AFLP指紋圖譜分析體系，為我國(guó)道地藥材白術(shù)的種質(zhì)保存和育種提供證據(jù)。其他如石斛［27］、絞股藍(lán)［28］、丹參［29］、纈草［30］等藥用植物都有應(yīng)用 DNA 指紋圖譜對(duì)其種質(zhì)資源進(jìn)行分析的報(bào)道，為進(jìn)一步應(yīng)用DNA指紋圖譜進(jìn)行資源鑒定和中藥育種學(xué)提供參考。

3.3 活性成分基因表達(dá)調(diào)控的研究 生物體內(nèi)的各種功能蛋白質(zhì)和酶都是相應(yīng)基因編碼、表達(dá)的產(chǎn)物，研究中藥材活性成分基因的差異表達(dá)對(duì)其不同特性、調(diào)控機(jī)理及基因功能的研究都有重要意義。藥用植物的生長(zhǎng)周期是基因在一定的時(shí)空中表達(dá)的結(jié)果，伴隨著相應(yīng)的次生代謝化學(xué)成分的產(chǎn)生。DNA指紋圖譜技術(shù)對(duì)于闡明藥用植物不同生長(zhǎng)期的分子調(diào)控機(jī)制有積極的意義，通過(guò)與cDNA等技術(shù)結(jié)合，可以達(dá)到篩選品質(zhì)基因，增加有效次生代謝產(chǎn)物合成量，提高藥材品質(zhì)的目的。

4 討論與展望

綜上所述，DNA指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)逐漸成為中藥材研究中的重要工具和手段。隨著DNA指紋技術(shù)的逐漸完善，其特異性和信息量逐漸增加，檢測(cè)的精確度越來(lái)越高，對(duì)于分子水平上鑒定中藥真?zhèn)巍⒌赖匦匝芯?、遺傳分析和育種以及有效成分的基因表達(dá)調(diào)控等方面的研究產(chǎn)生了劃時(shí)代的意義，具有廣闊的前景。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)和各技術(shù)間的相互結(jié)合使用，DNA指紋圖譜技術(shù)將會(huì)在中藥研究中發(fā)揮更大作用。

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