水產(chǎn)品中甲醛HPLC測定的前處理方法探討

董靚靚，朱軍莉，勵建榮

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州 310035)

水產(chǎn)品中甲醛HPLC測定的前處理方法探討

董靚靚，朱軍莉*，勵建榮*

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州 310035)

為了探討前處理方法對水產(chǎn)品甲醛檢測的影響，本文比較了三氯乙酸結(jié)合超聲提取法(超聲+TCA法)、三氯乙酸提取法(TCA法)、蒸餾水提取法、水蒸氣蒸餾法四種前處理方法的高效液相色譜法(HPLC)測定甲醛。結(jié)果顯示，水蒸氣蒸餾和三氯乙酸超聲提取平均回收率分別為109.06%和103.62%，而蒸餾水提取的回收率低于40%。經(jīng)優(yōu)化后的三氯乙酸超聲提取條件優(yōu)化為超聲時間25min，10%TCA加入量10mL。因此，三氯乙酸超聲提取具有穩(wěn)定性較好，操作簡便，與水蒸氣蒸餾法前處理效果相當，是一種適合用于大多數(shù)鮮活和冷凍水產(chǎn)品甲醛含量檢測的前處理方法。

前處理，甲醛，HPLC

甲醛是一種毒性很強的破壞生物細胞蛋白質(zhì)的原生物質(zhì)，對人的神經(jīng)系統(tǒng)、肺、肝臟均可產(chǎn)生損傷。甲醛已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸物質(zhì)，也是潛在的強致突變物之一［1］。因此，我國已禁止其作為添加劑加入到食品中［2］。但近年來大量調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)品中高含量的甲醛并非人為添加或者環(huán)境污染所致，而是在貯藏和加工過程中在內(nèi)源性酶等［3－9］催化下自然產(chǎn)生，如在冷凍和冰凍貯存過程中，魚肉中氧化三甲胺在氧化三甲胺酶的作用下分解為二甲胺和甲醛。檢測食品中甲醛時，樣品前處理方法影響樣品中甲醛的檢測值。首先，處理過程可能導(dǎo)致食品中內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生。如水產(chǎn)品中存在氧化三甲胺的分解、蛋白質(zhì)和脂肪的分解和氧化等，高溫蒸煮等過程會導(dǎo)致魷魚中甲醛含量的增加。研究發(fā)現(xiàn)，魷魚制品高含量的甲醛主要來源于加工中的熱處理工序，并且魷魚制品低溫貯存可以減少甲醛的生成［10］。且靳肖等人［11］通過建立魷魚絲氧化三甲胺熱分解模擬體系證實了加熱時間、加熱溫度和pH對氧化三甲胺熱分解有一定的影響。其次，不同前處理方法提取的甲醛形態(tài)不同。海產(chǎn)品中甲醛主要以3種方式存在［12］:一是自由型甲醛;二是可逆結(jié)合型甲醛;三是為不可逆結(jié)合型甲醛。海產(chǎn)品中甲醛對魚肉的影響不同，自由型甲醛對食品的毒性發(fā)生具有重要影響，結(jié)合型甲醛與凍魚組織蛋白結(jié)合，是導(dǎo)致魚在冰凍貯藏期間質(zhì)量下降的原因［13］。因此，不同的前處理方法會影響海產(chǎn)品中甲醛的檢測結(jié)果，目前食品中甲醛前處理方法主要有水蒸氣蒸餾法［14］和蒸餾水提取法［15］。水蒸氣蒸餾法能提取游離甲醛和可逆結(jié)合態(tài)甲醛，但不能避免食品中成分轉(zhuǎn)變分解或衍生形成內(nèi)源性甲醛［16］。蒸餾水提取法能提取食品中游離甲醛，但不能提取結(jié)合態(tài)甲醛。且樣品中富含蛋白質(zhì)時，易形成可逆結(jié)合態(tài)的蛋白質(zhì)－甲醛復(fù)合物，蒸餾水提取法提取時甲醛的添加回收率不佳。建立靈敏度高，抗干擾強的甲醛檢測技術(shù)是科學(xué)和準確的評價水產(chǎn)品中甲醛問題的前提。目前，測定甲醛的方法主要有分光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法。分光光度法檢測水產(chǎn)品和食品中的甲醛，原理簡單，操作簡便，呈色穩(wěn)定，但相對于色譜法來說，靈敏度低，抗干擾性差，而色譜方法抗干擾性強，具有靈敏性高、重復(fù)性好、精確度高等優(yōu)點。鄭斌等人［17］采用三氯乙酸提取水產(chǎn)品中的游離態(tài)甲醛，經(jīng)2，4－二硝基苯肼衍生化后，利用HPLC測定水產(chǎn)品中游離甲醛含量。為了探討不同樣品前處理對水產(chǎn)品中甲醛含量的影響，本文以甲醛本底含量較高的鱈魚、龍頭魚、魷魚為代表性海產(chǎn)品，系統(tǒng)的比較了三氯乙酸結(jié)合超聲提取法、三氯乙酸(TCA)溶液提取法、蒸餾水提取法、水蒸氣蒸餾法前處理方法，并采用準確、高效、抗干擾性強的高效液相色譜法［18］測定，旨在找到一種操作簡便、重復(fù)性好和回收率高的樣品前處理方法，為HPLC測定水產(chǎn)品中甲醛含量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2，4－二硝基苯肼、磷酸、NaOH 分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司;三氯乙酸(TCA) 分析純，杭州匯普化工儀器有限公司;Tris(base) 杭州昊鑫生物科技有限公司;甲醛標準溶液 100mg/L，國家環(huán)保總局;甲醇、乙腈 色譜純，TEDIA公司;實驗所用的水 均為超純水;秘魯魷魚(冷凍) 舟山興業(yè)公司;鱈魚(冷凍)、龍頭魚(冰鮮)和甲醛調(diào)查中的水產(chǎn)品及其制品 分別購買于杭州水產(chǎn)品批發(fā)市場、杭州市物美、樂購等大超市。

安捷倫1100高效液相色譜儀(配有紫外檢測器和Rev.A.06.03色譜工作站)、Agilent ODS2－C18柱(4.6mm×200mm，5μm) 美國安捷倫公司;高速冷凍離心機 德國Sigma公司;K－100型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;DKS－12型電熱恒溫水浴鍋上海經(jīng)濟區(qū)海鹽中新電器廠;W II－866型旋渦混合器太倉市科教器材廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 超聲+TCA法 稱取5.00g試樣至100m L具塞三角瓶中，加入40m L超純水，置于100W超聲儀中冰浴超聲25min，加10m L 10%TCA。取出后在10000 r/m in條件下離心 5min，取濾液用 1mol/L NaOH調(diào)pH至3左右，定容至50m L備用。

1.2.1.2 TCA法［17］稱取5.00g試樣至100m L具塞三角瓶中，加入40m L超純水，于室溫下靜置30m in，加入10m L 10%TCA。取出后在10000 r/m in條件下離心5m in，取濾液用1mol/L NaOH調(diào)pH至3左右，定容至50m L備用。

1.2.1.3 蒸餾水法［15］稱取5.00g試樣至100m L具塞三角瓶中，加入50m L超純水，旋緊塞子后漩渦振蕩1m in，于室溫下靜置30m in。取出后在10000 r/m in條件下離心5m in，取出濾液，定容至50m L備用。

1.2.1.4 水蒸氣蒸餾法［14］稱取10.00g試樣于蒸餾瓶中，加入20m L蒸餾水、適量沸石，用玻璃棒攪拌混勻。加入10m L體積濃度為10%磷酸溶液，立即通入水蒸氣蒸餾。接收管下口事先插入盛有10m L蒸餾水且置于冰浴的蒸餾液接收裝置中，收集蒸餾液至200m L。蒸餾液待用。

FPGA芯片的可重構(gòu)資源分區(qū)數(shù)量與位置信息固定，待布局邏輯功能個數(shù)、所需資源數(shù)量與種類等信息在布局前也已確定，并且在布局過程中不會發(fā)生變化，所以在UPRFloor布局策略中使用常量表示上述信息，具體定義如表1所示.

1.2.2 衍生和液相檢測 取制備好的提取液1m L于10m L具塞比色管中，加入 0.5m L的 1mg/m L的DNPH衍生劑后在60℃下加熱 40m in，冷卻后過0.45μm濾膜，取20μL進液相。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:ODS－C18柱;流速: 1.0m L/m in;流動相:甲醇∶水=70∶30;檢測器:紫外檢測器;波長:355nm。

1.2.4 澄清度測定 采用分光光度法，以蒸餾水作參比，用1cm比色皿，在410nm波長下測定透光率，用透光率(T%)表示上清液的澄清度［19］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 實驗重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標準偏差表達(Mean±SD)。用Microsoft Excel和Origin 7.5進行數(shù)據(jù)處理和作圖，并用 SPSS進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

本實驗選擇超聲+TCA提取、TCA提取、蒸餾水提取以及水蒸氣蒸餾四種方法分析秘魯魷魚(冷凍)、鱈魚(冷凍)和龍頭魚(冰鮮)樣品。從圖1結(jié)果顯示，秘魯魷魚和龍頭魚經(jīng)超聲+TCA提取、TCA提取、蒸餾水提取和水蒸氣蒸餾的含量分別為9.538，9.321，8.012，9.686mg/kg和 43.314，40.107，37.206，42.924mg/kg，而鱈魚經(jīng)四種前處理的含量為51.352，48.216，42.271和52.671mg/kg。可見，蒸餾水提取方法前處理的樣品甲醛檢出量低于其他前處理提取的樣品，表明該方法不能有效提取海產(chǎn)品中實際甲醛含量。而水蒸氣提取方法測得的樣品甲醛含量存在較大的標準偏差，這可能是由于水蒸氣蒸餾法存在較大稀釋倍數(shù)使提取液中的甲醛含量過低，造成較大誤差。

圖1 三種海產(chǎn)品甲醛檢測的不同前處理方法Fig.1 Different pre－treatmentmethods of formaldehyde determining in three kinds of seafood

由于海產(chǎn)品提取過程中水溶性蛋白的不斷溶出，加上超聲的強化作用，使得提取液較為渾濁，很難通過過濾離心等方式獲得清液，因此需要選擇適當?shù)脑噭┮猿ルs質(zhì)和蛋白質(zhì)。而TCA作為一種強酸，能很好地沉淀蛋白質(zhì)。用TCA沉淀蛋白后離心，可以獲得澄清的溶液。因此選擇10%TCA作為蛋白質(zhì)沉淀劑，并加入超聲強化提取，以提高甲醛提取量。該處理方法操作簡便、準確性高，穩(wěn)定性好，適合于海產(chǎn)品中甲醛的檢測。

本實驗以秘魯魷魚(冷凍)為實驗材料，加標后進行不同前處理后測定甲醛含量，不同前處理對魷魚甲醛加標回收率見表1。結(jié)果表明，水蒸氣蒸餾對魷魚樣品的回收率達到109.06%，雖然回收率較高，但平行性不高且操作繁雜。此外，對于本底含量較低的水產(chǎn)品，蒸餾液稀釋倍數(shù)相對較大會對測定結(jié)果造成一定誤差。蒸餾水提取法采用直接水提，不論是樣品中甲醛含量還是加標回收率都明顯偏低，因其提取過程中水溶性蛋白的溶出使得提取液較渾濁，不利于高效液相測定。因此，在水提的基礎(chǔ)上加入10%TCA作為蛋白質(zhì)沉淀劑，并加入超聲強化提取，以提高甲醛提取量。結(jié)果表明，TCA結(jié)合超聲的方法回收率為103.62%，能夠達到水蒸氣蒸餾法測定甲醛含量的效果，且穩(wěn)定性較好，操作簡便。因此，可以選TCA結(jié)合超聲法作為甲醛檢測的前處理。

表1 魷魚樣品四種前處理加標回收率Table 1 Different pre－treatmentmethods of formaldehyde recovery in squid

2.3 超聲三氯乙酸提取方法的優(yōu)化

2.3.1 超聲時間的不同對甲醛提取量的影響 本實驗以秘魯魷魚(冷凍)為實驗材料，考察超聲時間的不同對提取樣品中甲醛提取量的影響，其中樣品提取時蒸餾水和TCA添加量保持不變。由圖2可知，超聲時間的延長有利于樣品中甲醛的提取，這是因為超聲波的振動能產(chǎn)生強烈的空化及攪拌作用，加速有效成分溶入溶劑，提高樣品中有效成分的得率［20］。而當超聲時間到達25m in后，對甲醛的提取幾乎無顯著影響。因此，超聲時間選擇25m in較為合適。

2.3.2 TCA加入量對甲醛含量測定的影響 本實驗以秘魯魷魚(冷凍)為實驗材料，考察TCA加入量的不同對提取樣品中甲醛提取量和上清液澄清度的影響，其中樣品提取時超聲時間和樣品總提取體積保持不變。由圖3可知，TCA加入量對樣品中甲醛提取量影響不大，但因提取過程中水溶性蛋白的不斷溶出，TCA加入量對提取液的澄清度有很大影響。這是因為TCA作為一種良好的蛋白質(zhì)沉淀劑，一經(jīng)加入會使樣品中的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團，使之聚集沉淀［21］，一經(jīng)離心后就能得到較為澄清的上清液。從澄清度和TCA成本考慮，加入10m L的10%TCA較為合適。

圖2 超聲時間對甲醛提取量的影響Fig.2 Effect of ultra－sonic wave time on the extraction of formaldehyde

圖3 TCA加入量對甲醛提取量的影響Fig.3 Effect for extraction of formaldehyde in addition of TCA

2.3.3 pH對甲醛含量測定的影響 考慮到樣品的提取液使用的是強酸，pH在1左右，因此本實驗考察了pH對甲醛衍生及最終測定值的影響。

圖4 pH對甲醛含量測定的影響Fig.4 Effect for determination of formaldehyde in pH

本實驗以魷魚為實驗材料，采用最優(yōu)超聲+TCA提取方法獲得上清液。取適量上清液，用緩沖溶液調(diào)pH分別至2，3，4，5，6，7，考察不同pH對衍生產(chǎn)物產(chǎn)率(以衍生產(chǎn)物的峰面積來衡量)的影響。由圖4可見，pH在2～5范圍內(nèi)，衍生物的產(chǎn)率都表現(xiàn)較高的穩(wěn)定性，與文獻結(jié)果一致［22］，pH高于5時，甲醛檢測值下降。但考慮到樣品提取時采用的是強酸以及C18柱子的壽命，因此樣品經(jīng)超聲+TCA前處理后需把pH用緩沖溶液調(diào)節(jié)至3～5范圍間，以提高測定樣品甲醛的準確性。

2.4 水產(chǎn)品及其制品中甲醛含量調(diào)查結(jié)果

以TCA結(jié)合超聲和水蒸氣蒸餾作為樣品前處理方法，利用高效液相色譜法檢測了常見海產(chǎn)魚類、甲殼頭足類、淡水魚類和水產(chǎn)制品40種樣品，甲醛本底含量見表2。海產(chǎn)魚類中鱈魚類和母狗魚甲醛含量較高，甲醛檢出率為100%，其中鱈魚樣品甲醛含量高于49mg/kg;甲殼類和頭足類中甲醛含量較低，其含量低于10mg/kg，甲醛檢出率為100%，其中魷魚中甲醛含量相對較高，而貝類中甲醛含量很低;淡水魚中均未檢測出甲醛;而四類水產(chǎn)制品中均檢測出甲醛，其中龍頭魚制品中甲醛含量超過100mg/kg，魷魚和鱈魚制品中甲醛含量也較高，應(yīng)關(guān)注其食用安全。高效液相色譜檢測甲醛的兩種樣品前處理有一定差別，其中對于大多數(shù)鮮活和冷凍樣品而言，TCA超聲提取略大于或與水蒸汽蒸餾處理結(jié)果相似，表明了它是一種適合用于大多數(shù)鮮活和冷凍水產(chǎn)品甲醛含量檢測的前處理方法。水產(chǎn)品甲醛檢測結(jié)果與柳淑芳等［23］報道的食用魚甲醛本底含量研究一致，食用魚類的甲醛本底含量不同且差異較大，水產(chǎn)制品、海產(chǎn)魚類中不同狀態(tài)都檢測出了甲醛，海產(chǎn)魚類甲醛含量較高，而淡水魚類中未檢測出甲醛。同時，水產(chǎn)品中甲醛含量與品種和貯藏狀態(tài)時間有關(guān)，研究［24－25］表明海產(chǎn)魚類中普遍存在較高活性的甲醛生成酶系和高含量的氧化三甲胺，在凍藏過程中該酶可以分解氧化三甲胺生成等比例的甲醛和二甲胺，從而使海產(chǎn)魚類特別是鱈魚科等具有高含量的甲醛本底。

表2 水產(chǎn)品及其制品中甲醛含量調(diào)查結(jié)果Table 2 The amount of formaldehyde in various aquatic products

3 結(jié)論

三氯乙酸結(jié)合超聲提取法(超聲+TCA提取法)回收率高，提取相對較完全，能夠達到水蒸氣蒸餾法測定甲醛含量的效果，且穩(wěn)定性較好，操作簡便。因此，該方法是一種適合用于大多數(shù)鮮活和冷凍水產(chǎn)品中甲醛含量檢測的前處理方法。

［1］庚晉，周潔.甲醛污染的危害［J］.建材產(chǎn)品應(yīng)用，2002(5): 49－51.

［2］中華人民共和國食品衛(wèi)生法［S］.1995－10－30.

［3］Rehbein H，SchreberW.TMAO－ase activity in tissues of fish species from the northeast Altantic［J］.Comp Biochem Physiol，1984，79B(3):447－452.

［4］Kalasz H.Biological role of formaldehyde，and cycles related tomethylation，demethylation，and formaldehyde production［J］. Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2003，3(3):175－192.

［5］MACKIE L M，THOMSON B W.Decomposition of trimthylamine oxide during iced and frozen storage of whole and comminuted tissue offish［C］.Proc IV International Congress Food Science and Technology，1974:243－250.

［6］吳富忠，韓宏偉，黃麗君.魷魚及其制品中甲醛本底值與產(chǎn)生原因分析［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，19(2):38－39.

［7］勵建榮，曹科武，賈佳，等.利用電子自旋共振(ESR)技術(shù)對秘魯魷魚中甲醛生成非酶途徑中相關(guān)自由基的研究［J］.中國食品學(xué)報，2009，9(1):17－20.

［8］黃和，田金玲.國內(nèi)外水產(chǎn)品中甲醛含量分析的研究進展［J］.中國食物與營養(yǎng)，2009(2):17－20.

［9］朱軍莉，勵建榮，苗林林，等.基于高溫非酶途徑的秘魯魷魚內(nèi)源性甲醛的控制［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2010，34(3):375－381.

［10］朱軍莉，勵建榮.魷魚及其制品加工貯存過程中甲醛的消長規(guī)律研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(5):14－17.

［11］靳肖，周德慶，孫永.魷魚絲氧化三甲胺熱分解模擬體系的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(3):106－108.

［12］BECHMANN I E.Comparison of the formaldehyde content found in boiled and raw mince of frozen saithe using defferent analyticalmethods［J］.Lebensm－Wissu－Technol，1998，31: 449－453.

［13］ANG JF，HULTIN H O.Denaturation of cod myosin during freezing after modification with formaldehyde［J］.Food Science，1989，54:814－818.

［14］SC/T 3025－2006.水產(chǎn)品中甲醛的測定［S］.國家水產(chǎn)行業(yè)標準，2006.

［15］SN/T 1547－2005.進出口食品中甲醛含量測定－液相色譜法［S］.北京:中國標準出版社，2005.

［16］李薇霞，朱軍莉，勵建榮，等.奶糖中內(nèi)源性甲醛關(guān)鍵形成物質(zhì)的初步研究［J］.食品工業(yè)科技，2011(6):124－126，273.

［17］鄭斌，陳偉斌，徐曉林，等.常見水產(chǎn)品中甲醛的天然含量及風(fēng)險評估［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，26 (1):6－11.

［18］Li JR，Zhu J L，Ye L F.Determination of formaldehyde in squid products by HPLC［J］.Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition，2007，16(1):127－130.

［19］李開鋒，徐玉娟，張友勝，等.玫瑰茄提取液澄清工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(3):184－187.

［20］彭川叢，孔靜，游麗君，等.超聲波輔助熱水浸提香菇多糖響應(yīng)面優(yōu)化工藝及其抗氧化活性的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(4):452－456.

［21］郭立安，閻哲，張曉楠，等.三氯乙酸對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001(22):22.

［22］陳笑梅，施旭霞，朱衛(wèi)建，等.高效液相色譜直接測定甲醛衍生物反應(yīng)條件的研究［J］.分析化學(xué)，2004，32(11):1421－1425.

［23］柳淑芳，杜永芳，朱文慧，等.食用魚類甲醛本底含量研究初報［J］.海洋水產(chǎn)研究，2005，26(6):77－82.

［24］Kimura M，Seki N，Kimura I.Occurrence and some properties of trimethylamine－N－oxide demethylase in myofibrillar fraction from walleye pollack muscle［J］.Fisheries Science，2000，66: 725－729.

［25］Benjakul S，Visessanguan W，Tanaka M.Induced formation of dimethylamine and formaldehyde by lizardfish (Saurida micropectoralis)kidmey trimethylamine－N－oxide demethylase［J］.Food Chemistry，2004，84:297－305.

Study on pre－treatmentmethods for determ ination of formaldehyde in aquatic products by HPLC

DONG Liang－liang，ZHU Jun－li*，LI Jian－rong*
(College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China)

In order to investigate the effects of p re－treatmentmethods on determ ination of formaldehyde in food，the experiment，four p re－treatmentmethods，trichloroacetic acid combined w ith ultra－sonic extraction(ultra－sonic+ TCA)，trichloroacetic acid solution extrac tion(TCA)，water extraction and steam d istillation was com pared in determ ination of formaldehyde by high performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the average recovery of steam d istillation and ultra－sonic+TCA method were 109.06%and 103.62%，respec tively，whereas，water extraction was of less than 40%.The op tim ized cond itions of TCA combined w ith ultra－sonic were ultrasonic time of 25m in and 10%TCA add ition value of 10m L.Therefore，TCA comb ined w ith ultra－sonic exhibited sim ilar result in extraction of formaldehyde compared w ith steam distillation.The method w ith sim p le operation，and good stability，could be app lied to determ ine the formaldehyde in fresh and frozen aquatic p roduc ts.

p re－treatment;formaldehyde;HPLC

TS254.7

A

1002－0306(2012)12－0064－05

2011－10－12 *通訊聯(lián)系人

董靚靚(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:食品檢測。

國家自然科學(xué)基金(31000761);高等學(xué)校博士學(xué)科點基金(20113326130001);國家科技支撐計劃(2012BAD29B00)。