雙標(biāo)記13C，15N3－呋喃妥因的制備

徐建飛，杜曉寧，王 偉，張 彰

（1.上海大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海200444； 2.上?；ぱ芯吭?上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心，上海200062）

雙標(biāo)記13C，15N3－呋喃妥因的制備

徐建飛，2，杜曉寧2，王 偉2，張 彰1＊

（1.上海大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海200444； 2.上?；ぱ芯吭?上海穩(wěn)定同位素工程技術(shù)研究中心，上海200062）

以雙標(biāo)記13C，15N3－氨基脲為原料，先與苯甲醛縮合，繼而與氯乙酸乙酯取代、環(huán)化，再經(jīng)鹽酸水解反應(yīng)后與5－硝基糠醛二乙酯反應(yīng)，最終制得雙標(biāo)記13C，15N3－呋喃妥因.產(chǎn)物經(jīng)紅外光譜、高效液相色譜及質(zhì)譜表征.結(jié)果表明，所選用的合成路線反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物總收率高于60%，且同位素豐度不下降；目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)純度＞99.0%，13C同位素豐度＞98%，15N同位素豐度＞99%.

氨基脲；13C；15N；雙標(biāo)記呋喃妥因；制備

呋喃妥因，化學(xué)名為1－｛［（5－硝基－2－呋喃基）亞甲基］氨基｝－2，4－咪唑烷二酮，最初由美國(guó) Norwich Eaton制藥公司研制［1］，屬硝基呋喃類廣譜抗菌藥物.早期曾被廣泛用作動(dòng)物飼料添加劑，后發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的細(xì)胞誘變性和動(dòng)物致癌毒性［2］，因而在飼料生產(chǎn)中遭到全面禁用［3］.另外，鑒于呋喃妥因也能作為化妝品添加劑，為避免含有此類藥物的化妝品給消費(fèi)者帶來危害，我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》［4］中明確規(guī)定這種藥物在化妝品中為禁用物質(zhì).為了對(duì)飼料和化妝品中的呋喃妥因進(jìn)行檢驗(yàn)，常需使用雙標(biāo)記13C，15N3－呋喃妥因作為內(nèi)標(biāo)物，通過同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）［5－6］進(jìn)行定量的分析測(cè)定.

目前，同位素標(biāo)記的呋喃妥因合成方法還未見報(bào)道，但非標(biāo)記呋喃妥因的制備方法主要有以下兩種：1）JULIAN等［7］采用呋喃與1－氨基海因反應(yīng)，中間體再經(jīng)混酸硝化后，即得呋喃妥因；2）章思規(guī)［8］和JACK［9］將水合肼與尿素縮合，再在堿性條件下與氯乙酸乙酯縮合等多步反應(yīng)制得.但采用上述方法合成13C和15N雙標(biāo)記呋喃妥因均存在不足.前一方法引入同位素標(biāo)記很難，且產(chǎn)生大量的廢酸；而后一方法則需使用大量同位素標(biāo)記的水合肼，成本較高.綜合上述兩種合成方法，作者以自制的13C，15N3－氨基脲為原料［10］，經(jīng)苯甲醛保護(hù)后，先與氯乙酸乙酯縮合環(huán)化，所得中間體經(jīng)鹽酸水解后再與5－硝基糠醛二乙酯反應(yīng)，最終制得13C，15N3－呋喃妥因的雙標(biāo)記化合物.該方法操作簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少，產(chǎn)物收率高于60%，且沒有同位素豐度的稀釋現(xiàn)象.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與儀器

13C，15N3－氨基脲（自制），氯乙酸乙酯（Sigma－Aldrich公司），5－硝基糠醛二乙酯（百靈威化學(xué)試劑有限公司），呋喃妥因標(biāo)樣（TCI），其余均為市售的國(guó)產(chǎn)試劑.

數(shù)顯熔點(diǎn)儀 WRS－1B（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Magna－IR－550型紅外光譜儀（Nicolet Co.），WATERS1525型高效液相色譜儀（WATERS Co.），同位素質(zhì)譜計(jì)（Finnigan Co.），LC－MS（Thermo Electron Co.）.

1.2 制備方法

13C，15N3－呋喃妥因的合成路線見圖1.

圖1 13 C，15 N3－呋喃妥因的合成路線（＊為同位素標(biāo)記位置）Fig.1 The synthesis route of 13 C，15 N3－nitrofurantoin（＊is the isotope labeled）

1.2.1 苯亞甲基氨基脲（Ⅱ）的制備

在三口瓶中加入苯甲醛（0.1mol）和氨基脲鹽酸鹽（0.1mol），50%的乙醇水溶液作為溶劑，50℃下反應(yīng)1h.反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過濾、水洗、醇洗和真空干燥，得到白色固體（Ⅱ），收率93%.m p 214～215℃；ESIMSm／z：164.1［M＋H］＋，186.0［M＋Na］＋.

1.2.2 苯亞甲基氨基乙內(nèi)酰脲（Ⅲ）的制備

將0.1mol苯亞甲基氨基脲（Ⅱ）置于500mL三口瓶中，加入乙醇鈉（0.1mol）的無水乙醇溶液（50 mL）.滴加氯乙酸乙酯30mL，反應(yīng)回流數(shù)小時(shí).將反應(yīng)物濃縮至干，用稀堿液溶解固體并過濾除去不溶物，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH＝6～7，過濾收集固體.真空干燥后得到白色粉末（Ⅲ），收率83%.m p 254～255℃；ESI－MSm／z：204.6［M＋H］＋，226.1［M＋Na］＋.

1.2.3 1－氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽（Ⅳ）的制備

將苯亞甲基氨基乙內(nèi)酰脲（Ⅲ）15g加入到50mL鹽酸溶液（6mol／L）中，加熱并回流.反應(yīng)過程中同時(shí)進(jìn)行水蒸氣蒸餾，以除去苯甲醛.反應(yīng)液經(jīng)活性炭脫色、蒸干后，用乙醇重結(jié)晶，得到白色結(jié)晶物（Ⅳ），收率85%.m p 199～200℃；ESI－MSm／z：116.1［M＋H］＋.

1.2.4 呋喃妥因（Ⅴ）的制備

在裝有回流冷凝管、溫度計(jì)的三口瓶中，加入1－氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽1.5g，水10mL.再緩慢滴加2.5g 5－硝基糠醛二乙酯的乙醇溶液10mL，在冰水浴下緩慢加入濃硫酸3mL，加熱反應(yīng)2h.結(jié)束后冷至5～10℃，逐漸有黃色固體析出，過濾后固體用水洗至中性，再用乙醇洗滌.用DMF重結(jié)晶得到黃色固體（Ⅴ），50℃下真空干燥4h，收率92%.m p 258～261℃（分解）；IR：（KBr），σ／cm－1：3 624.7，3 479.2（NH），3 141.3，3 019.0（C－H），1 732.4（═C O），1 614.7（═C C），1 437.3（NO2）.ESI－MSm／z：237.15［M－H］－.

1.2.5 高豐度標(biāo)記物合成實(shí)驗(yàn)

以自制高豐度13C，15N3－氨基脲為原料，替代天然豐度氨基脲，按上述方法合成13C，15N3－呋喃妥因，收率60%，13C豐度98.10%，15N豐度為99.08%，化學(xué)純度為99.0%.ESI－MSm／z：241.14［M－H］－.

1.3 分析方法

純度分析采用液相色譜方法［11－12］分析13C，15N3－呋喃妥因.HILIC C－18柱，流動(dòng)相：A（CH3OH）／B（H2O）／C（HCOOH）＝26∶73∶1，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm，流速1mL／min.采用MAT271質(zhì)譜計(jì)，用微量法制備樣品［13－14］，分析其13C，15N的同位素豐度.LC－MS分析離子源為ESI，模式為正或負(fù)離子模式.

2 結(jié)果與討論

2.1 苯亞甲基氨基脲（Ⅱ）的合成

2.1.1 溶劑、溫度的影響

實(shí)驗(yàn)選用了不同的溶劑和反應(yīng)溫度，以考察它們對(duì)中間體—苯亞甲基氨基脲（Ⅱ）收率的影響.實(shí)驗(yàn)操作方法參見1.2.1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.

表1 溫度、溶劑對(duì)中間體（II）產(chǎn)率的影響Table 1 Effect of temperature and solvent on yield of intermediate（II）

由表1可以看出，用純水、乙醇作溶劑時(shí)，因苯甲醛在水中溶解度較差，氨基脲鹽酸鹽在乙醇中的溶解度非常低，致使收率偏低.采用水／醇（V／V＝1∶1）混合溶劑時(shí)，則收率有明顯的提高，且以水／乙醇（V／V＝1∶1）為溶劑時(shí)最佳.從反應(yīng)溫度看，隨著反應(yīng)溫度的升高，收率也逐步升高，但反應(yīng)溫度達(dá)60℃時(shí)，產(chǎn)物收率趨于恒定，且產(chǎn)品顏色偏黃，可能是副產(chǎn)物所致，故選擇反應(yīng)溫度以50℃更為適宜.

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間的影響

另外，我們還就反應(yīng)時(shí)間對(duì)中間體（Ⅱ）收率的影響進(jìn)行了探索.在50℃下，以水／乙醇1∶1（V／V）為混合溶劑，分別選取反應(yīng)時(shí)間為0.5、1.0、2.0、3.0和4.0h進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較，其結(jié)果見表2.

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)中間體（Ⅱ）收率的影響Table 2 Effect of reaction duration on yield of intermediate（II）

從表2可以看出，收率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但超過3h后，產(chǎn)物外觀變黃，這可能是副反應(yīng)所致，故選擇反應(yīng)時(shí)間2h為宜.

2.2 1－氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽（Ⅳ）的合成

根據(jù)上述合成路線，第3步為酸性水解反應(yīng)，其目的是脫除保護(hù)基，而制得中間產(chǎn)物—1－氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽（Ⅳ）.實(shí)驗(yàn)過程中，就體系酸濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物收率的影響作了相應(yīng)研究，實(shí)驗(yàn)操作步驟參見1.2.3，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3 酸度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)1－氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽（Ⅳ）收率的影響Table 3 Effect of acid concentration，reaction duration on yield of AHD.HCl（Ⅳ）

顯然，酸的濃度過低時(shí)，不能將1－氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽全部水解；濃度過高時(shí)，則容易發(fā)生串聯(lián)副反應(yīng)，而導(dǎo)致產(chǎn)物的收率下降，所以選擇6mol／L最為適宜.另一方面，在反應(yīng)初期，產(chǎn)物收率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大；當(dāng)達(dá)到3h后，產(chǎn)物收率基本趨于恒定，約85%.

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

呋喃妥因（Ⅴ）合成反應(yīng)所涉及的影響因素較多，包括5－硝基糠醛二乙酯和1－氨基乙內(nèi)酰脲的摩爾比（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）等，為此本實(shí)驗(yàn)采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索，并以呋喃妥因產(chǎn)物收率作為考察指標(biāo)，對(duì)其反應(yīng)工藝條件作優(yōu)化處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4.

表4 L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)表及極差RTable 4 Dates and range Rof L9（34）

從表4中R值的直觀分析可以看出，各因素對(duì)呋喃妥因收率的影響程度是：原料摩爾比（A）＞反應(yīng)溫度（B）＞ 反應(yīng)時(shí)間（C）.原料摩爾比（A）對(duì)呋喃妥因的收率有著極為顯著的影響，而反應(yīng)時(shí)間對(duì)呋喃妥因的收率則幾乎沒有影響，由正交表中結(jié)果可知，合成呋喃妥因反應(yīng)的最優(yōu)化條件是：原料摩爾比為1.1∶1.0，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間取3h.

另外，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其呋喃妥因收率為92.0%，純度99.0%以上，完全符合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

2.4 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 HPLC

以市售天然豐度的呋喃妥因試劑為外標(biāo)，通過HPLC的測(cè)試分析，證明本實(shí)驗(yàn)所合成的產(chǎn)物為13C，15N3－呋喃妥因，其純度為99.0%.

2.4.2 LC－MS

實(shí)驗(yàn)就合成產(chǎn)物—13C，15N3－呋喃妥因進(jìn)行了質(zhì)譜測(cè)試分析.根據(jù)結(jié)構(gòu)其標(biāo)記分子量為242，負(fù)離子模式為［M－H］－即241.譜圖顯示m／z＝241.14與理論值完全相符，因此，可確定合成所得的標(biāo)記樣品為13C，15N3－呋喃妥因.

2.4.3 MAT 271同位素質(zhì)譜的豐度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)使用微量法制備樣品，用MAT271質(zhì)譜計(jì)測(cè)得：13C，15N3－呋喃妥因的13C同位素豐度為98.10%，15N同位素豐度為99.08%.原料氨基脲的15N同位素豐度為99.26%，13C同位素豐度為98.40%，其同位素稀釋效應(yīng)的影響小于0.5%.

根據(jù)以上HPLC、MS和MAT271同位素質(zhì)譜分析的測(cè)試結(jié)果，可以確定本實(shí)驗(yàn)合成所得化合物的結(jié)構(gòu)與13C，15N3－呋喃妥因完全一致，且同位素豐度未被稀釋.

結(jié)論：設(shè)計(jì)并合成了雙標(biāo)記13C，15N3－呋喃妥因化合物，并對(duì)反應(yīng)工藝作了詳細(xì)的探索.通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得出合成最優(yōu)化工藝條件，中間體苯甲醛縮氨基脲的收率達(dá)93.0%，經(jīng)氯乙酸乙酯縮合成環(huán)反應(yīng)、鹽酸水解反應(yīng)，再與5－硝基糠醛二乙酯反應(yīng)，最終制得目標(biāo)產(chǎn)物—13C，15N3－呋喃妥因，總收率60%以上.另一方面，合成產(chǎn)物經(jīng)HPLC、MS與同位素質(zhì)譜分析等測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)制得的產(chǎn)物與設(shè)計(jì)的目標(biāo)產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)完全一致，且化學(xué)純度＞99.0%，13C同位素豐度＞98.10%，15N同位素豐度＞99.08%，同位素稀釋效應(yīng)影響小于0.5%.

雙標(biāo)記13C，15N3－呋喃妥因的合成制備，對(duì)飼料和化妝品中添加劑的檢測(cè)提供了分析依據(jù)，對(duì)呋喃類內(nèi)標(biāo)試劑的國(guó)產(chǎn)化研究及我國(guó)食品和化妝品安全體系的建立，均具有著十分重要的意義.

［1］戚雪勇，吳修艮.呋喃妥因的合成新工藝［J］.化學(xué)世界，2007，48（4）：252.

［2］祝偉霞，劉亞風(fēng).動(dòng)物性食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測(cè)研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010（2）：99－102.

［3］張 慶，王 超，王 星，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中的呋喃妥因和呋喃唑酮［J］.色譜，2009（2）：237－239.

［4］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范 ［S］.北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2007，28：42.

［5］劉衛(wèi)霞，羅 勇，楊維成.有機(jī)同位素稀釋質(zhì)譜法在食品安全分析中的應(yīng)用［J］.化學(xué)世界，2011（3）：184－187.

［6］周 霄，王 軍，張麗娟.同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)量環(huán)境樣品中的微量元素［D］.北京：中國(guó)科學(xué)院上海冶金研究所，2000.

［7］JULIANG M，NORWICH N Y.Nitrating an N－（2－furyl）alkylidene hydrazing compound：US，2898335［P］.1959－08－04.

［8］章思規(guī).精細(xì)有機(jī)化學(xué)品技術(shù)手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，1991：20－21.

［9］JACK D H，SUTNO G H.Preparation of 1－aminohydrantoin derivatives：US，2990402［P］.1961－06－27.

［10］王 偉，杜曉寧，劉占峰，等.13C，15N－鹽酸氨基脲合成方法的優(yōu)化［J］.同位素，2010（4）：206－210.

［11］MOTTIER P.Quantitative determination of four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography－electrospray ionisation－tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2005，1067（1／2）：85－91.

［12］祝偉霞，楊冀州，魏 巍，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物性食品中硝基呋喃類代謝物殘留［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2008（1）：47－50.

［13］杜曉寧，宋明鳴，趙 誠(chéng)，等.13C－尿素的同位素豐度檢測(cè)方法［J］.同位素，2010（1）：40.

［14］杜曉寧，宋明鳴，趙 誠(chéng).質(zhì)譜檢測(cè)用15N樣品的處理方法［J］.原子能科學(xué)技術(shù)，2009（12）增刊：60.

Preparation of double labeled13C，15N3－nitrofurantoin

XU Jianfei ，DU Xiaoning，WANG Wei ，ZHANG Zhang
（1.School of Environmental ＆Chemical Engineering，Shanghai University，Shanghai 200444，China；2.Shanghai Engineering Research Center of Stable Isotope，Shanghai Research Institute of Chemical Industry，Shanghai 200062，China）

A novel method was established to synthesize double labeled13C，15N3－nitrofurantoin.Starting material13C，15N3－semicarbazide was firstly converted to benzaldehyde semicarbazone（II）by condensation with benzaldehyde.Compound（II）was then allowed to react with ethyl α－chloroacetate in the presence of sodium ethoxide，forming 1－benzylideneaminohydratoin（III）.Compound（III）was hydrolyzed with hydrochloric acid and condensed with 5－nitro furfural diacetate，generating the target compound，nitrofurantoin－（13C，15N3）（V）.As－synthesized target product was characterized by infrared spectrometry，high－performance liquid chromatography，and mass spectrometry.It has been found that the established synthetic route is dominated by mild reaction conditions and gives rise to the final product in a yield of above 60%，while the abundance of the isotopes does not tend to decline.Namely，the chemical purity of the target product is above 99.0%，and the abundances of13C and15N are above 98%and 99%，respectively.

nitrofurantoin；13C；15N；double labeled semicarbazide；preparation

O 621.3

A

1008－1011（2012）04－0001－05

2012－02－21.

徐建飛（1979－），男，碩士生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程與工藝.＊

.E－mail：zhzhang9＠shu.edu.cn.