凡納濱對蝦腸道微生物宏基因組Solexa測序及其初步分析

嚴雪平, 袁劍波, 劉 斌

(1. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049)

凡納濱對蝦腸道微生物宏基因組Solexa測序及其初步分析

嚴雪平1,2, 袁劍波1,2, 劉 斌1

(1. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 研究生院, 北京 100049)

CTAB-酚/氯仿法提取新鮮凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)腸道微生物宏基因組DNA。結(jié)果表明： CTAB-酚/氯仿法提取總DNA的濃度達到92.5 ng/μL, 半定量PCR法檢測微生物基因組相對含量為69.9%。凡納濱對蝦腸道微生物宏基因組用于 Solexa測序, 生物信息學分析結(jié)果顯示宏基因數(shù)據(jù)中64.1%的數(shù)據(jù)屬于未知序列, 35.5%屬于真核生物, 而已知的微生物和病毒序列所占比例僅有0.4%。

腸道微生物宏基因組; CTAB; Solexa測序

海洋動物腸道內(nèi)共附生著大量的微生物, 形成了一個特定的微生態(tài)群落。研究海洋動物腸道微生物的基因組結(jié)構(gòu)有利于理解這類微生物的生理生化特征, 對開發(fā)海洋微生物產(chǎn)生的抗腫瘤、抗菌等生物活性物質(zhì)有著重要的意義[1]。但因現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)的局限性, 從可培養(yǎng)微生物中獲得活性物質(zhì)越來越難[2]。自1998年Handelsman等[3-4]提出宏基因組學的概念以來, 宏基因組學在微生物資源的開發(fā)、活性物質(zhì)的篩選等方面等得到了廣泛的應用但是宏基因組測序費用昂貴、所需基因組DNA至少在10 μg以上, 而實際上有些宏基因組 DNA難以獲得, 且常有外源DNA的污染, 因此獲得高純度足量的宏基因組DNA成為宏基因組研究瓶頸之一[5]。在現(xiàn)實工作中往往需要大量采樣、大量提取基因組才能滿足要求, 不僅費時費力且容易造成實驗誤差和結(jié)果的不穩(wěn)定, 又由于宏基因組測序往往是大規(guī)模、高通量, 費用昂貴、測得序列數(shù)據(jù)量大, 序列拼接組裝繁雜耗時, 因此宏基因組測序前進行 DNA的定性定量檢測非常必要。半定量PCR技術(shù)經(jīng)常用于評估樣本中靶基因的分子數(shù), 實現(xiàn)對核酸信息的量化分析及比較, 結(jié)果可靠、操作方便[6-10]。但目前, 有關(guān)這方面的報道還不多。研究探索一種微生物宏基因組DNA評價方法在宏基因組研究方面具有重要的意義。

水生動物與陸生恒溫動物一樣腸道微生物豐富,其中有相當一部分微生物長期定居在動物腸道中,與宿主的營養(yǎng)、代謝、免疫等一些列生理生化過程密切相關(guān)[11-13]。研究人員發(fā)現(xiàn)在人及多種動物中, 多種生理功能是有定居在腸道中的微生物的參與得以實現(xiàn)[14-15], 例如： 2010年Hehemann[16]研究發(fā)現(xiàn)存在于海洋桿菌(Zobellia galactanivorans)基因組中編碼Porphyranases酶的基因也存在于人腸道微生物日本人腸道桿菌(Bacteroides plebeius)基因組中, 這種酶能幫助人分解利用海藻植物類營養(yǎng), 腸道宏基因組的比較分析表明 Porphyranases在日本人中常見, 但并不存在于北美人群中。凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)作為重要的海、 淡水經(jīng)濟養(yǎng)殖對蝦, 凡納濱對蝦是尋找益生菌和抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)的重要物種之一[12,17]。作者以凡納濱對蝦腸道微生物為研究對象, 提取了腸道微生物宏基因組 DNA, 以細菌16S為靶基因、凡納濱對蝦18S rDNA為內(nèi)參對微生物宏基因組中宿主DNA污染的程度進行半定量研究, 以期建立一種便捷、可靠的檢測宏基因組 DNA純度和濃度的方法。同時對測得宏基因組數(shù)據(jù)進行初步生物信息學分析, 進行相關(guān)物種鑒定分析和宏基因組功能初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑

健康成體凡納濱對蝦(體長 10～14 cm)采自青島東海灣對蝦養(yǎng)殖場。微生物基因組提取試劑盒(DP302-02)購于天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 宏基因組DNA提取

青島東海灣對蝦養(yǎng)殖場采健康成體凡納濱對蝦45尾, 實驗室條件下養(yǎng)殖 48 h, 以盡量排空腸道。70%酒精體表消毒, 無菌操作取出整個腸道。腸道浸泡于PBS緩沖, 充分振蕩5～10 min后1000 r/min離心 10 min, 取上清。PBS洗滌 3次腸道, 合并上清10 000 r/min離心10 min收集菌體。PBS清洗3次。收集到的菌體以 CTAB-酚/氯仿法提取基因組。CTAB-酚/氯仿法參考李可[17]、Fridez等[18]。最后以200 μL TE 溶解 DNA。

1.2.2 宏基因組DNA定量

提取的宏基因組DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 同時利用微量紫外可見分光光度計 NanodropND-1000分別測定其濃度和純度, 重復3次。

1.2.3 半定量PCR法評價宏基因組DNA

以細菌 16S rDNA為靶基因, 凡納濱對蝦 18S rDNA為內(nèi)參, 分別代表細菌和宿主基因組, 進行半定量PCR檢測所提取宏基因組中微生物基因組和宿主凡納濱對蝦基因的相對含量。設(shè)置3組平行對照,重復 3次, 每組取兩個 PCR反應結(jié)果電泳檢測。Bio-Rad的1D凝膠定量生物學軟件Quantity One -4.6.2分析電泳檢測結(jié)果。

1.2.3.1 引物設(shè)計

根據(jù) GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上的凡納濱對蝦的 18S序列設(shè)計引物： F3445： 5’-TAGGGGTGTTGGGGACG-3’, B4795： 5’-AACATTGTCTTTCCCACGC-3’, 片段長度為 1034bp。細菌 16S通用引物, 27-F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,1492-R： 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’,擴增片度長度約為 1 500 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.3.2 半定量PCR的條件

以提取的宏基因組為模板進行半定量 PCR檢測。PCR反應按照25 μL體系。半定量PCR的反應條件： 95℃5 min, 94℃45 s, 57.9℃50 s, 72℃1 min10 s, 26 循環(huán), 72℃10 min。

1.3 凡納濱對蝦腸道微生物宏基因組Solexa測序及初步分析

將提取的凡納濱對蝦腸道微生物宏基因組DNA送杭州華大基因用于Solexa測序, Perl編程統(tǒng)計出所有reads的每個位點的4種堿基頻率和質(zhì)量分數(shù)值去除測序質(zhì)量較差的reads, Velvet軟件拼接成contigs,進一步采用 Blast 將蝦的宏基因組序列組裝文件Shrimp.contigs 利 用 NCBI(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRA MS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome)上 Nt 數(shù)據(jù)庫進行比對(e 值限定為 1e-5), 得到 Blast 的文件,生物信息學分析參考Mitra等[19-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組DNA電泳檢測及紫外分光光度計定量檢測

從電泳結(jié)果看, CTAB-酚/氯仿法提的總 DNA片段均比較完整, 條帶清晰明亮, 主帶在 23kbp(圖1)。紫外吸光光度計測得數(shù)據(jù)表明所提取的宏基因紫外吸收峰在260 nm處, OD260/OD280的比值平均值為1.75, 表明所提取的宏基因組 DNA質(zhì)量較好。濃度檢測結(jié)果顯示所提取的宏基因組 DNA濃度為 92.5 mg/L, 最終所提取的總DNA量為18.5 μg。

圖1 提取腸道微生物宏基因組電泳檢測Fig. 1 The gel electrophoresis of intestinal microflora metagenomeM.λ-Hind III digest maker; 1.CTAB-酚/氯仿法提取的樣品宏基因組DNAM.λ-Hind III digest maker; 1. Metagenome DNA extracted by CTAB- phenol/chloroform protocol

2.2 宏基因組DNA半定量PCR檢測

Quantity One分析電泳檢測結(jié)果表明： CTAB-酚氯仿提取新鮮樣品中微生物基因組平均相對含量為69.9%。

圖2 半定量測定提取宏基因組中微生物基因組的含量Fig. 2 The content of bacterial genomes in metagenome detected by Semi-quantitative PCRM. DL2000 marker; 1-6. 宏基因組半定量PCR擴增; B. blank對照; B’. 細菌16S; N. 凡納濱對蝦18SM. DL2000 marker; 1-6. Metagenome as template for semi-quantative PCR; B. Blank control; B’. Bacterial 16S DNA; N：Shrimp 18S DNA

2.3 宏基因組 DNA Solexa測序結(jié)果生物信息學初步分析

由于用于Solexa測序所需DNA至少在10 μg以上, 所提基因組達到測序要求。將所提宏基因組DNA用于新一代測序技術(shù) Solexa測序法測序。Solexa測序總共得到4.65G的數(shù)據(jù)20441981條reads,共計3924860352個堿基, GC含量為49.65%, 進一步將所得到的reads序列經(jīng)去除引物接頭等冗余序列以Velvet軟件拼接組裝成contigs。在此基礎(chǔ)上, 將拼接的contigs中重復的、序列過短、分值不高的contigs去除, 選取其中的一個最優(yōu)匹配結(jié)果作為該 contigs的比對信息, 這樣就得到的是每一條 contig對應唯一的一個比對信息得到19994條contigs。作者進一步將蝦的宏基因組序列組裝contigs序列與 Nt 數(shù)據(jù)庫進行 Blast比對(e 值限定為 1e-5), 得到 blast 的結(jié)果用 MEGAN 軟件分析相關(guān)物種的豐度和進化關(guān)系圖結(jié)果如圖 3 (圓圈越大, 代表比對上的 contig越多), 結(jié)果顯示只有 31條contigs個是與細菌基因組序列相關(guān)(大部分為弧菌屬Vibrio), 有 7 106條contigs與真核生物序列相關(guān), 24條contigs為病毒序列。其余的contigs均是已知序列但是功能未知(1 856條)和未比對上 contigs(10 977條), 表明宏基因組測序中含有較多未知物種, 他們的序列都未被測定,所以需要進一步的實驗驗證。與數(shù)據(jù)中占35.5%的真核生物序列比對上的物種類群主要有： (1)凡納濱對蝦數(shù)據(jù)4 701條; (2)頂復動物亞門的物種(原生動物)相關(guān)序列1 290條。數(shù)據(jù)中占64.1%的未知功能序列和未比對上序列極有可能是蝦腸道中獨特的或未被測定的微生物種群基因組序列, 研究這些序列有助于進行相關(guān)未培養(yǎng)的細菌研究。

作者進一步將所得宏基因組數(shù)據(jù)用 MG-RAST軟件(e值限定在1e-5, 采用的數(shù)據(jù)庫是NCBI數(shù)據(jù)庫,不限定比對長度)分析, 結(jié)果與 MEGAN軟件分析較一致。序列功能分析采用的數(shù)據(jù)庫是NOG和KEGG的數(shù)據(jù)庫(e值限定在 1e-5, 不限定比對長度), 分析結(jié)果顯示所得宏基因組數(shù)據(jù)中與細菌細胞分裂相關(guān)功能項包含序列最多, 此外 RNA代謝, 碳水化合物代謝還有氨基酸代謝和衍生物合成這 3大功能項包含的序列也較多。此外, 作者分別下載NCBI中所有質(zhì)粒序列和抗性質(zhì)粒序列, 構(gòu)建成質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫和具有抗性的質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫, 將所測宏基因組數(shù)據(jù)與質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫和抗性質(zhì)粒數(shù)據(jù)庫進行比對, 發(fā)現(xiàn)其中34條contigs與質(zhì)粒數(shù)據(jù)相關(guān), 具有抗性質(zhì)粒相關(guān)的contigs 29條。其中抗性相關(guān)序列中有12條contigs與固氮螺菌(Azospirillumsp.)所含質(zhì)粒序列相關(guān), 11條 contigs與耐金屬貪銅菌(Cupriavidus metallidurans)中的質(zhì)粒序列相關(guān)。

3 討論

隨著宏基因組學的不斷發(fā)展, 越來越多的環(huán)境微生物和動物腸道微生物正在被人們重視[6]。如何獲得這些腸道固有微生物的基因組并有效地減少宿主的基因組和外源DNA是研究動物腸道微生物宏基因組的關(guān)鍵[2,5,17]。本實驗中, 作者采用 CTAB-酚氯仿法提取新鮮樣品組 DNA, 其基因組 DNA濃度達到92.5 mg/L, 且DNA片段完整。半定量PCR檢測微生物相對含量為 69.9%, 與宏基因組測序結(jié)果比較存在一定的偏差, 可能是由于本實驗只擴增了細菌16S, 忽略了古細菌和真核微生物(真菌、原生動物)等, 這會使微生物基因組的含量在結(jié)果中偏低。其次,選擇單個基因作為靶基因、內(nèi)參基因, 在一定程度上忽略了微生物基因組和凡納濱對蝦染色體基因組大小的差異, 容易造成微生物基因組結(jié)果偏高。因此,可設(shè)置多個內(nèi)參以便更科學地測算宿主與微生物基因組相對比。宏基因組技術(shù)在研究環(huán)境及未可培養(yǎng)微生物活性物質(zhì)方面有著廣泛的應用[23-24], 本研究中宏基因測序結(jié)果分析表明已知微生物基因組序列比較較少, 但其中含有大量的序列屬于已被其他研究測定但功能未知微生物基因組序列, 提示是蝦腸道中含有較多的獨特的或未被測定的微生物種群。所測序列中含有真核生物相關(guān)序列較多, 這可能與蝦腸道中寄生有原生動物有關(guān)。宏基因組數(shù)據(jù)中存在大豆、玉米等高等植物基因組, 這可能與蝦餌料等因素相關(guān)[25]。在宏基因組數(shù)據(jù)中, 發(fā)現(xiàn)部分的質(zhì)粒相關(guān)序列, 顯示蝦腸道微生物中可能含有編碼相關(guān)抗生素的某些基因。作者的研究為宏基因組DNA提取及檢測提供了很好的思路, 宏基因組測序和生物信息學分析對這類特殊微生物群落的遺傳特性、生理生化功能基本特征有初步了解, 為蝦類病蟲害的防治以及健康養(yǎng)殖等應用研究提供了一定科學依據(jù)。

表1 Quantity One-4.6.2分析半定量PCR條帶的相對含量Tab. 1 Quantity One-4.6.2 analysis of semi-quantitative PCR electrophoresis bands

圖3 MEGAN軟件分析宏基因組數(shù)據(jù)相關(guān)物種豐度和進化關(guān)系樹Fig. 3 MEGAN software analysis abundance and Phylogenetic tree of species in metagenome

[1] Glad T, Bernhardsen P, Nielsen K M, et al. Bacterial diversity in faeces from polar bear (Ursus maritimus)[J].Arctic Svalbard BMC Microbiol, 2010, 10(10)： 1-10.

[2] 李慧, 何晶晶, 張穎, 等.宏基因組技術(shù)在開發(fā)未培養(yǎng)環(huán)境微生物基因資源中的應用[J]. 生態(tài)學報, 2008,28(4)： 1762-1771.

[3] Handelsman J, Rondon M R, Brady S F, et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes： a new frontier for natural products[J]. Chem Biol, 1998, 5(10)： 245-249.

[4] 李麗娟, 張殷昌, 龔世園. 宏基因組技術(shù)在開發(fā)未培養(yǎng)微生物資源中的應用[J]. 水利漁業(yè), 2007, 27(3)：7-9.

[5] Poniat H N, Schearz C, Qi J, et al. Metagenomics to paleogenomics： large-scale sequencing of mammoth DNA [J]. Sci, 2006, 311： 392-394.

[6] 孫奮勇, 萬大方, 覃文新, 等. 基因組半定量PCR方法檢測腫瘤組織的基因缺失[J]. 腫瘤, 2000, 20(2)：135-137.

[7] 李春艷, 高文信, 張茹慧, 等.半定量 PCR 檢測口腔鱗狀細胞癌凋亡蛋白酶活化因子的表達[J] .實用口腔醫(yī)學雜志, 2008, 24(6)： 110-112.

[8] 劉青, 魏華. 兩種半定量 PCR方法在鯽雌激素樣效

應研究中的應用[J]. 水產(chǎn)學報, 2006, 30(6)： 416-420.[9] Salone A, Nikkila J, Tuovinen J J, et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray： effective recovery of bacteria and archaeal DNA using mechanical cell lysis[J]. J Microbiol Methods, 2010, 81(2)： 127-134.

[10] 馬媛媛, 鄒少蘭, 張鯤, 等. 半定量 RT-PCR 檢測運動發(fā)酵單胞菌中外源基因轉(zhuǎn)錄水平的研究[J]. 微生物學通報, 2009, 36(6)： 831-836.

[11] Navarrete P, Espejo R T, Romero J. Molecular analysis of microbiota along the digestive tract of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar L.)[J]. Microb Ecol, 2009,57(3)： 550-561.

[12] Wang X H, Li H R, Zhang X H, et al. Microbial flora in the digestive tract of adult penaeid shrimp(Penaeus chinensis)[J]. Journal of Ocean University of Qingdao,2000, 30(3)： 493-498.

[13] Worthen P L, Gode C J, Graf J. Culture-independent characterization of the digestive-tract microbiota of the medicinal leech reveals a tripartite symbiosis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(7)：4775-4781.

[14] Tannock G W. Molecular assessment of intestinal microflora[J]. AJCN, 2001, 73 (suppl)： 410-414.

[15] Kurokawa K, Itoh T, Kuwahata T, et al. Comparative metagenomics revealed commonly enriched gene sets in human gut microbiomes [J]. DNA Res, 2007, 14(4)：169-181.

[16] Hehemann H J, Correc G, Barbeyron T, et al. Transfer of carbohydrate-active enzymes frommarine bacteria to Japanese gut microbiota[J]. Nat, 2010, 464： 908-914.

[17] 李可, 鄭天凌, 田蘊, 等. 南美白對蝦腸道微生物群落的分子分析[J]. 微生物學報, 2007, 47(4)： 649-653.

[18] Fridez F, Coquoz R. PCR DNA typing of stamps：evaluation of the DNA extraction[J]. Forensic Sci Int,1996, 78(2)： 103-110.

[19] Mitra S, Klar B,Huson D H. Visual and statistical comparison of metagenomes[J]. Bioinformatics, 25(15)：1849-1855.

[20] Mitra S, Gilbert J A, Field D, et al. Comparison of multiple metagenomes using phylogenetic networks based on ecological indices[J]. The ISME Journal, 2010,4： 1236-1242.

[21] Poinar H N, Schwarz C, Qi J, et al. Metagenomics to paleogenomics： large-scale sequencing of mammoth DNA[J]. Sci, 2006, 311： 392-394.

[22] Huson D H, Auch A F, Qi J, et al. MEGAN analysis of metagenomic data [J]. Genome Res, 2007, 17(3)：377-386.

[23] Grant S, Grant W D, Cowan D, et al. Identification of eukaryotic open reading frames in metagenomics cDNA libraries made form environmental samples[J]. Aem,2006, 72(1)： 135-143.

[24] Cowan D, Meyer Q, Stafford W, et al. Metagenomic gene discovery： past, present and future[J]. Trends Biotechnol, 2005, 23(6)： 321-329.

[25] Oxley A P A, Shipton W, Owens L, et al. Bacterial flora from the gut of wild and cultured banana prawn,Penaeus merguiensis[J]. J Appl Microbiol, 2002, 92(2)：214-223.

Solexa sequencing and analysis of the intestinal microorganisms metagenome in Litopenaeus vannamei

YAN Xue-ping1,2, YUAN Jian-bo1,2, LIU Bin1
(1. Key Laboratory of Experimential Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Qingdao 266071, China; 2.Graduate University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049,China)

Apr., 15,2011

intestinal microfloar metagenome; CTAB; solexa sequencing

The intestinal microorganisms metagenome of Litopenaeus vannamei was extracted by CTAB-phenol/chloroform DNA extraction protocol. The relative concentration of bacterial genome in metagenome was analyzed by semi-quantitative PCR. The results showed that the total concentration of metagenome was 92.5 mg/L and relative microbial metagenome ratio was 69.9%. Solexa sequencing showed that up to 64.1% of contigs in metagenome had no assignment or no hits in database of NCBI, 35.5% of which were assigned to eukaryon, and only 0.4% sequences belonged to bacteria and virus.

Q89

A

1000-3096(2012)06-0009-06

2011-04-15;

2011-05-16

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2007AA09Z444)

嚴雪平(1985-), 男, 碩士研究生, 主要從事海洋微生物宏基因組研究, 電話： 0532-82898957, E-mail： yanxueping007@126.com; 劉斌, 通信作者, 電話： 0532-82898857, E-mail： bliu@qdio.ac.cn

(本文編輯：譚雪靜)