歐李ChPSY基因的原核表達

陳俊奇，王鵬飛，杜俊杰，李潤豐，洪文泓，李 佩，馬精選，張建成

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

類胡蘿卜素是自然界中分布最為廣泛的一大類色素，不僅賦予植物花、果實等器官鮮艷的色彩，還在光合作用、ABA和芳香物質(zhì)合成中起重要作用[1-2]。八氫番茄紅素合成酶（Phytoene synthase，PSY）是類胡蘿卜素生物合成途徑中的第1個限速酶，它催化2個分子GGPP（牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸）聚合形成八氫番茄紅素，其編碼基因已成為人們應(yīng)用基因工程技術(shù)調(diào)控植物類胡蘿卜素的生物合成，改善果樹、蔬菜和花卉等園藝植物觀賞性能、營養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟價值的首選靶基因[1，3]。目前，已從番茄、煙草、柑橘、向日葵、玉米、甜瓜等多種植物中相繼克隆獲得編碼PSY的完整基因或部分片段序列[4-9]。研究表明，大部分植物中僅含有單一的PSY基因，而番茄、玉米和水稻等少數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)了2個或3個表達有差異的PSY基因，其表達不僅具有器官或質(zhì)體特異性，而且受環(huán)境脅迫的影響[10-12]。番茄中克隆到2個PSY基因，其中，PSY1在花和果實中特異性表達，而PSY2主要在葉片中表達[13-14]。此外，在玉米、水稻等谷類植物中分離獲得PSY3基因，該基因主要是在根系中表達，參與調(diào)控植株對干旱、鹽漬、溫度和強光等非生物脅迫的反應(yīng)[11-12]。

歐李（Cerasus humilis（Bge）Sok）屬于薔薇科櫻桃屬，是我國特有的一種果、牧、藥兼用的樹種[15]。歐李果實色澤鮮艷、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，是一種倍受消費者青睞的特色保健水果，尤其是果實富含花青素、黃酮醇和類胡蘿卜素等多種色素物質(zhì)，其具有很高的開發(fā)利用和研究價值[15]。目前，歐李果實類胡蘿卜素代謝生理及調(diào)控研究的報道相對較少，而有關(guān)歐李果實類胡蘿卜素生物合成途徑中相關(guān)基因分離及鑒定的研究報道甚少。

本研究將從歐李果實分離的八氫番茄紅素合成酶基因ChPSY cDNA克隆到原核表達載體pET-28a（+），并進行了蛋白誘導(dǎo)表達的研究，旨在為歐李八氫番茄紅素合成酶基因生物學(xué)功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

歐李ChPSY cDNA全長序列由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹學(xué)分子生物實驗室從歐李農(nóng)大4號成熟果實中克隆保存[16]。大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3），pMD-18T克隆載體及 pET-28a（＋）原核表達載體由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹學(xué)分子生物實驗室保存；限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I，Taq聚合酶和T4DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；硝酸纖維素膜為Pallman公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍R-250和DAB為Sigma進口分裝；單克隆抗體鼠源抗6×His為QIAGEN公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑或藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 歐李ChPSY基因的序列比較分析 利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），BLASTx（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）和 MEGA 4.0軟件（Neighbor-Joining，鄰接法）對歐李ChPSY cDNA全長序列進行生物信息分析。

1.2.2 歐李ChPSY基因重組表達載體的構(gòu)建根據(jù)已克隆歐李ChPSY基因的核苷酸序列和原核表達載體pET-28a（+）的特點合成1對引物，即上游引物為 PSY-F：5′-CGGGATCCATGTCAG GTGTT-3′（下劃線處為BamHⅠ位點）和下游引物為 PSY-R：5′-CCGCTCGAGTCTTGACACCAA-3′（下劃線處為XhoⅠ位點），擴增歐李ChPSY基因的完整開放讀碼框序列。反應(yīng)條件：94℃3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收酶切片段與經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-28a（+）在T4連接酶作用下16℃連接過夜。然后，按常規(guī)的方法進行轉(zhuǎn)化和篩選，挑取單菌落進行PCR、酶切和測序鑒定，確保重組質(zhì)粒pET-ChPSY的序列及其讀碼框正確。

1.2.3 歐李ChPSY基因的誘導(dǎo)表達 將構(gòu)建正確的pET-ChPSY轉(zhuǎn)化E.coli BL21，挑取陽性克隆接種于含有 Kanr（50 μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，再按1∶100的比例接種于相同的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L誘導(dǎo)表達4 h，同時設(shè) pET-28a（+）空白對照，分別取樣進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白有無表達[17-20]。設(shè)置 0，0.4，0.8，1.0，1.2 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達，觀察不同濃度的IPTG在誘導(dǎo)4 h后蛋白的表達量；IPTG濃度為1.2 mmol/L條件下，分別誘導(dǎo) 0，1，2，4，6 h 后取樣，觀察不同誘導(dǎo)時間下蛋白的表達量[21]。

1.2.4 歐李ChPSY基因表達產(chǎn)物的鑒定 將蛋白質(zhì)凝膠電泳帶轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC膜），轉(zhuǎn)印后的NC膜用PBS封閉，室溫輕搖過夜，加入鼠源抗6×His的單克隆抗體，室溫輕搖反應(yīng)2 h，PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，室溫輕搖作用2 h，PBST洗滌3次。然后，將轉(zhuǎn)印膜置于DAB顯色液中，加入10～20 μL 30%的H2O2，迅速輕輕搖勻，直至條帶清晰，用PBS漂洗終止反應(yīng)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李ChPSY基因序列分析

歐李ChPSY基因由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹學(xué)分子生物實驗室從農(nóng)大4號歐李成熟果實中克隆，該基因cDNA序列全長1 559 bp，最大開放讀碼框為1 194 bp，編碼398個氨基酸，5′和3′端分別為195，170 bp的非編碼序列（圖1-A）。歐李ChPSY基因所推導(dǎo)的氨基酸序列與草莓、胡蘿卜和高粱PSY的氨基酸序列長度相似，同源性分別為92%，78%和81%。此外，聚類分析也表明，歐李與草莓、胡蘿卜和高粱PSY蛋白親緣關(guān)系較近，聚為同一類（圖1-B）。

2.2 歐李ChPSY基因重組表達載體的構(gòu)建

采用PSY-F和PSY-R引物PCR擴增獲得1條約1.2 kb的條帶，與預(yù)期的擴增目的片段大小吻合。

將PCR產(chǎn)物和pET-28a（+）載體進行連接，經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定均獲得約1.2 kb片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。測序結(jié)果表明，質(zhì)粒pET-ChPSY中確實含有目的片段，且讀碼框正確，表明原核表達載體pET-ChPSY構(gòu)建成功。

2.3 歐李ChPSY基因的原核表達與SDSPAGE分析

將重組質(zhì)粒pET-ChPSY轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）過夜培養(yǎng)，然后加入1.0 mmol/LIPTG誘導(dǎo)4 h，取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明，pET-ChPSY轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）獲得了表達，在大約45.8 kD處有1條特異蛋白條帶出現(xiàn)，與預(yù)期分子量大小相吻合，而相應(yīng)的對照pET-28a（+）則沒有該條帶（圖 3）。

進一步分析不同濃度IPTG和不同誘導(dǎo)時間對ChPSY蛋白表達量的影響，結(jié)果表明，分別加入 0，0.4，0.8，1.0，1.2 mmol/LIPTG 誘導(dǎo)蛋白表達時，當(dāng)濃度為1.2 mmol/L時，誘導(dǎo)蛋白的表達量最大（圖4-A）；濃度為1.2 mmol/L時，分別誘導(dǎo)0，1，2，4，6 h 后取樣進行 SDS-PAGE 電泳，結(jié)果表明，誘導(dǎo)6 h，ChPSY蛋白的表達效果最好（圖4-B）。因此，歐李ChPSY蛋白在IPTG濃度為1.2 mmol/L誘導(dǎo)6 h時，表達效果最好。

2.4 歐李ChPSY基因表達產(chǎn)物的Westernblotting

利用鼠源抗6×His單克隆抗體為一抗和羊抗鼠IgG-HRP為二抗，對歐李ChPSY基因表達產(chǎn)物進行Western-blot檢測。結(jié)果表明，在45.8kD處出現(xiàn)1條特異性的雜交條帶，沒有雜帶，表明該融合蛋白PSY-6×His具有良好的反應(yīng)活性（圖5）。

3 討論

在高等植物中，類胡蘿卜素是在質(zhì)體中通過類異戊二烯途徑合成的一大類萜類色素物質(zhì)，其不僅賦予水果、蔬菜和花卉等鮮艷的色彩，還對癌癥、心腦血管疾病和維生素A缺乏癥等多種人類疾病具有預(yù)防或保健功效[3]。八氫番茄紅素合成酶（PSY）是植物類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其編碼基因成為應(yīng)用基因工程技術(shù)改善植物類胡蘿卜素含量的首選目的基因[1]。Ye等[23]將植物黃水仙的PSY，LCYb和細菌的CrtI共同轉(zhuǎn)入水稻，使得轉(zhuǎn)基因水稻種子中形成類胡蘿卜素，因其內(nèi)胚乳呈金黃色而被譽為“黃金水稻”，內(nèi)胚乳（干質(zhì)量）中β-胡蘿卜素含量高達1.6 μg/g。之后，該研究小組利用玉米PSY替代黃水仙PSY，獲得黃金水稻2代轉(zhuǎn)基因植株，內(nèi)胚乳（干質(zhì)量）中的β-胡蘿卜素含量大幅度提升到37 μg/g[24]。轉(zhuǎn)基因黃金水稻的誕生極大地鼓舞了人們開展作物類胡蘿卜素品種改良的信心，油菜、玉米、亞麻、擬南芥、番茄、馬鈴薯、山金柑等多種其他作物相繼獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因果實、塊莖、籽粒等器官或組織中的類胡蘿卜素得以明顯改善或提高[25-26]。

蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物，要闡明植物胡蘿卜素合成的分子調(diào)控機理，還需要從蛋白質(zhì)水平進一步研究，而利用大腸桿菌進行外源基因原核表達是進行蛋白質(zhì)研究常用的一種方法。Misawa等[27]將番茄PSY基因在大腸桿菌中進行了融合表達，當(dāng)N端進行系列缺失后均能正常表達，但全長基因卻未能獲得表達，表明番茄PSY蛋白跨膜信號肽對該酶的催化活性具有明顯的抑制作用。本研究將歐李ChPSY基因編碼區(qū)在大腸桿菌BL21（DE3）中進行了融合表達，獲得的目標(biāo)蛋白主要以不溶的包涵體形式出現(xiàn)，但仍有部分是可溶性的，且該重組蛋白PSY-6×His具有良好的反應(yīng)活性。本試驗通過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，可以增加可溶性融合蛋白的含量，但還有必要進一步優(yōu)化歐李ChPSY基因的原核表達體系，以便提高誘導(dǎo)表達蛋白的可溶性含量，從而有利于后續(xù)歐李ChPSY酶蛋白純化、酶活比較分析以及位點突變等相關(guān)酶學(xué)特性研究，并為通過轉(zhuǎn)基因手段改良歐李和其他作物類胡蘿卜素品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

[1]朱長甫，陳星，王英典.植物類胡蘿卜素生物合成及其相關(guān)基因在基因工程中的應(yīng)用[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2004，30（6）：609-618.

[2]陶俊，張上隆.園藝植物類胡蘿卜素的代謝及其調(diào)節(jié)[J].浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2003，29（5）：585-590.

[3]Fraser P D，Bramley P M.The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids [J].Progress in Lipid Research，2004，43：228-265.

[4]Ray J，Moureau P，Bird C，et al.Cloning and characterization of gene involved in phytoene synthesis fromtomato[J].Plant Molecular Biology，1992，19：401-404.

[5]Busch M，Seuter A，Hain R.Functional analysis of the early steps ofcarotenoid biosynthesis in Tobacco[J].Plant Physiology，2002，128：439-453.

[6]Ikoma Y，Komatsu A，Kita M，et al.Expression of a phytoene synthase gene and characteristic carotenoid accumulation during citrus fruit development[J].Physiology Plantarum，2001，111（2）：232-238.

[7]Salvini M，Bernini A，F(xiàn)ambrini M，et al.cDNA cloning and expression ofthe phytoene synthase gene in sunflower[J].Journal of Plant Physiology，2005，162：479-484.

[8]Wong J C，Lambert R J，Wurtzel E T，et al.QTL and candidate genes phytoene synthase and ζ-carotene desaturase associated with the accumulation of carotenoids in maize[J].Theoretical Applied Genetics，2004，108：349-359.

[9]Karvouni Z，John I，Taylor J E，et al.Isolation and characterisation ofa melon cDNAclone encodingphytoene synthase[J].Plant Molecular Biology，1995，27：1153-1162.

[10]Bramley P，Teulieres C，Blain I，et al.Biochemical characterization oftransgenic tomatoin which carotenoid biosynthesis has been inhibited through the expression of antisense RNA to pTOM5[J].The Plant Journal，1992，2：343-349.

[11]Li F，Vallabhaneni R，Wurtzel E T.PSY3，a New Member of the Phytoene Synthase Gene Family Conserved in the Poaceae and Regulator of Abiotic Stress-Induced Root Carotenogenesi[J].Plant Physiology，2008，146：1333-1345.

[12]Welsh R，Wust F，Bar C，et al.A Third Phytoene Synthase Is Devoted to Abiotic Stress-Induced Abscisic Acid Formation in Rice and Defines Functional Diversification of Phytoene Synthase Genes[J].Plant Physiology，2008，147：367-380.

[13]Fraser P D，Truesdale MR，Bird C R，et al.Carotenoid Biosynthesis during Tomato Fruit Development：Evidence for Tissue-Specific Gene Expression[J].Plant Physiology，1994，105：405-413.

[14]BartleyGE，Scolnik P A.cDNAcloning,expression duringdevelopment,and genome mappingofPSY2，a second tomatogene encoding phytoene synthase[J].Journal of Biology Chemistry，1993，268：25718-25721.

[15]常虹，蘭彥平，周家華，等.歐李花色苷的分離及其鑒定[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：59-63.

[16]張建成，杜俊杰，劉和，等.歐李八氫番茄紅素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大腸桿菌中的功能表達[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（23）：4848-4857.

[17]張建成，陶能國，仝鑄，等.‘紅肉臍橙’八氫番茄紅素合成酶基因克隆與原核表達 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（10）：3200-3207.

[18]張曉娟，郝子琪，楊大威，等.棗樹ZjAPX基因的原核表達[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：189-192.

[19]李雅軒，李蕊，孟凡臣，等.大豆吡哆醛激酶基因的克隆與表達分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2009，24（3）：23-27.

[20]盧其能，楊清，沈春修.馬鈴薯類黃酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆與表達分析 [J].華北農(nóng)學(xué)報，2009，24（4）：11-16.

[21]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：14-16.

[22]金冬雁，黎孟楓.分子克隆實驗指南[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1998：862-897.

[23]Ye X D，Al-Babili S，Kl?ti A，et al.Engineering the provitamin A （β-carotene）biosynthetic pathway into（carotenoid-free）rice endosperm[J].Science，2000，287：303-305.

[24]Paine J A，Shipton C A，Chaggar S，et al.Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content[J].Nature Biotechnology，2005，23（4）：482-487.

[25]Botella-PaviaP，Rodriguez-ConcepcionM.Carotenoidbiotechnologyin plants for nutritionallyimproved foods[J].Physiologia Plantarum，2006，126：369-381.

[26]Giuliano G，Tavazza R，Diretto G，et al.Metabolic engineering ofcarotenoid biosynthesis in plants[J].Trends in Biotechnologyl，2008，26（3）：139-145.

[27]Misawa N，Masamoto K，Hori T.Expression of an Erwinia phytoene desature gene not only confers multiple resistance to herbicides interfering with carotenoid biosynthesis but also alters xanthophylls metabolism in transgenic plants[J].The Plant Journal，1994，6：481-489.