阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠不同腦區(qū)老年斑的觀測(cè)

林 仁 王 瑋 朱元貴 趙小貞△

1（福建醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，福州 350122）

2（福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院老年病研究所，福州 350001）

阿爾茨海默病是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)退行性疾病，老年斑是其的重要病理征之一［1－3］。本實(shí)驗(yàn)采用七月齡雌性轉(zhuǎn)基因小鼠模型，分別應(yīng)用Aβ免疫組織化學(xué)染色法與改良Bielshowsky鍍銀染色法觀察小鼠大腦皮質(zhì)第一運(yùn)動(dòng)區(qū)（primary motor cortex，M1）、大腦皮質(zhì)第二運(yùn)動(dòng)區(qū)（secondary motor cortex，M2）、齒狀回（gyrus dentatus，GD）、海馬CA1區(qū)（field CA1of hippocampus，CA1）、海馬CA3 區(qū)（field CA3of hippocampus，CA3），尾殼核（caudate putamen nucleus，CPu）以及小腦（cerebellum，Cb）等七個(gè)腦區(qū)老年斑的分布，以期探討二種方法檢測(cè)老年斑的可靠性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

七月齡阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因雌性小鼠7只（體質(zhì)量：40±3g，由美國(guó)Mary Jo Ladu教授惠贈(zèng)），其中野生型小鼠3只，突變型4只。

1.2 Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力

實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6天，記錄從進(jìn)入水中到找到平臺(tái)的時(shí)間定為逃避潛伏期，取四個(gè)象限逃避潛伏期均值作為平均逃避潛伏期，進(jìn)入水中后搜索平臺(tái)的路徑定為搜索策略。

1.3 實(shí)驗(yàn)鼠處理

小鼠經(jīng)灌注取腦、石蠟包埋，進(jìn)行5μm 與10 μm 交替連續(xù)冠狀切片，10張5μm 和5張10μm 計(jì)為一個(gè)模塊，共3模塊。5μm 切片備做酶免疫組織化學(xué)染色，10μm 切片備做改良Bielshowsky鍍銀染色。

1.4 酶免疫組織化學(xué)染色

具體步驟參照邁新生物科技公司UltraSensitiveTM S－P超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)。一抗：兔抗Aβ（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），加PBS 1∶400稀釋。陰性片以PBS代替一抗。

1.5 改良Bielshowsky鍍銀染色

切片常規(guī)脫蠟脫水，經(jīng)3%硝酸銀水溶液、10%甲醛水溶液、氨銀乙醇液、8%甲醛水溶液后5%硫代硫酸鈉液固定，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。

1.6 體視學(xué)計(jì)量

應(yīng)用每小格1.5×1.5的測(cè)試網(wǎng)格計(jì)數(shù)陽(yáng)性物數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)應(yīng)用

SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件包，秩和檢驗(yàn)分析改良Bielshowsky鍍銀染色與Aβ酶免疫組織化學(xué)染色的老年斑計(jì)數(shù)，并分析二者計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型小鼠和突變型小鼠小鼠平均逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；卡方檢驗(yàn)分析小鼠的搜索策略，結(jié)果顯示兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

表1 野生型小鼠與突變型小鼠搜索策略的比較Table 1 Comparison of search strategy between wild type mice and mutant

2.2 Aβ酶免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

AD 轉(zhuǎn)基因小鼠不同腦區(qū)均可見(jiàn)棕黃色均質(zhì)狀物的細(xì)胞質(zhì)中，且在突變型小鼠的M1、M2、CA1、CA3、GD、CPu的細(xì)胞外聚積成大小不一的棕黃色老年斑（見(jiàn)圖1）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，Aβ在突變型小鼠與野生型小鼠腦內(nèi)的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MWU＝6361，P＜0.05）。在M1、M2、CA1、CA3、GD 及CPu腦區(qū)，野生型與突變型小鼠Aβ的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。但在Cb中，兩組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Aβ免疫反應(yīng)陽(yáng)性物在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠不同腦區(qū)的分布（Aβ免疫組織化學(xué)染色，×400）Fig 1 Immunohistochemical stains were positive for Aβin the different brain regions of AD transgenic mice

2.3 改良Bielshowsky鍍銀染色結(jié)果

除Cb外，突變型小鼠各腦區(qū)均可見(jiàn)類(lèi)圓形的棕黑色斑塊，斑塊大小、數(shù)量不一。秩和檢驗(yàn)分析顯示，棕黑色斑塊在突變型小鼠與野生型小鼠腦內(nèi)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MWU＝2597.5，P＜0.05）。其中，突變型小鼠M1、M2、CA1、CA3、GD 可見(jiàn)大量類(lèi)圓形的棕黑色斑塊；而在Cpu僅少量出現(xiàn)，且斑塊較小。野生型小鼠M1、M2、CA1、CA3、GD 及Cpu只有少量不典型、體積較小的棕黑色類(lèi)圓形斑塊出現(xiàn)（見(jiàn)圖2）。突變型小鼠和野生型小鼠在上述區(qū)域中均未發(fā)現(xiàn)典型神經(jīng)元纖維纏結(jié)。經(jīng)體視學(xué)計(jì)數(shù)后統(tǒng)計(jì)分析顯示，棕黑色斑塊在突變型小鼠與野生型小鼠的M1、M2、CA1、CA3、GD 及Cpu等相應(yīng)腦區(qū)中的分布有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。

圖2 老年斑在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的分布 改良Bielshowsky染色（bar＝50μm）Fig 2 The distribution of senile plaque in cerebral region of AD transgenic mice（bar＝50μm）

表2 突變型小鼠與野生型小鼠的相應(yīng)腦區(qū)的老年斑及Aβ比較的MWU值Table 2 MWU value of the comparison of senile plaques and Aβin the different brain regions of wild－type mice and mutant type

2.4 Aβ與老年斑的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性散點(diǎn)圖分析，Aβ免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)物與改良Bielshowsky染色老年斑在阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)表達(dá)量可能存在相關(guān)性（見(jiàn)圖3）。經(jīng)相關(guān)分析結(jié)果顯示二者表達(dá)量呈正相關(guān)（r＝0.228，P＜0.01）。

圖3 改良Bielshowsky染色與Aβ免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性物散點(diǎn)圖Fig.3 The scatter diagram shows correlation analysis results of Aβ immunohistochemistry and senile plaque

3 討論

阿爾茨海默病是一種以記憶力衰退、判斷力和理解力下降為主要表現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。為進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制，研究者根據(jù)其發(fā)病機(jī)制假說(shuō)，建立多種動(dòng)物模型，如慢性缺血性癡呆模型、轉(zhuǎn)基因模型、膽堿能功能損傷模型等。模型建立的成功與否直接決定后續(xù)研究的成敗。老年斑與神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成是阿爾茨海默病的二個(gè)重要病理特征。Aβ聚積引起細(xì)胞外老年斑的形成，被認(rèn)為在阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程中起著核心作用［4］。此外，Aβ還促使Tau蛋白的磷酸化，后者是神經(jīng)纖維纏結(jié)的重要原因［5－6］。

已有臨床流行病學(xué)研究表明，AD 的發(fā)病具有明顯的性別差異，更年期后的女性AD 的患病率明顯升高［7］。本實(shí)驗(yàn)采用七月齡雌性AD 轉(zhuǎn)基因小鼠，分別應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力、應(yīng)用改良Bielshowsky鍍銀染色法與Aβ免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)病理特征老年斑。Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示，野生型小鼠的搜索策略較突變型小鼠好，提示未發(fā)生AD 的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)于AD小鼠。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型小鼠與突變型小鼠在平均逃避潛伏期無(wú)明顯差異，其原因可能是由于小鼠的運(yùn)動(dòng)能力存在差異（本實(shí)驗(yàn)未對(duì)兩組小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)，對(duì)此感到遺憾）及本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)目較少引起的統(tǒng)計(jì)偏差有關(guān)。

改良Bielshowsky鍍銀染色法及Aβ酶免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)老年斑或神經(jīng)纖維纏結(jié)的發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在突變型小鼠的腦內(nèi)均有大量陽(yáng)性物出現(xiàn)，而野生型小鼠腦內(nèi)只偶見(jiàn)少數(shù)陽(yáng)性物出現(xiàn)。其中，Aβ酶免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見(jiàn)野生型小鼠和突變型小鼠腦的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有均質(zhì)狀A(yù)β分布，且在突變型小鼠腦內(nèi)可見(jiàn)Aβ聚積形成類(lèi)圓形棕黃色斑塊，斑塊分布廣泛，大小不一。改良Bielshowsky染色可見(jiàn)突變型小鼠腦內(nèi)有大量類(lèi)圓形的棕黑色老年斑，老年斑大小不一，分布廣泛。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示，老年斑在野生型小鼠與突變型小鼠腦的M1、M2、CA1、CA3、GD、Cpu區(qū)的分布存在差異。兩種染色方法均顯示老年斑在Cb中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。改良Bielshowsky染色的陽(yáng)性反應(yīng)物與Aβ酶免疫組織化學(xué)染陽(yáng)性物經(jīng)體視學(xué)計(jì)數(shù)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)性。提示Bieshowsky染色結(jié)果與Aβ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致。在由此可見(jiàn)，改良Bielshowsky銀染法和Aβ免疫組織化學(xué)染色法均可做為AD 模型可靠的檢測(cè)方法。當(dāng)然，改良Bielshowsky鍍銀染色法和免疫組織化學(xué)法各有利弊，改良Bielshowsky鍍銀染色法在器械與容器的清潔方面要求較高，否則易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。但成功的改良Bielshowsky鍍銀染色結(jié)果能清晰觀察到典型老年斑的形態(tài)特征。且改良Bielshowsky鍍銀染色法具有穩(wěn)定性較好，敏感度高，重復(fù)性好等特點(diǎn)，可作為檢測(cè)老年斑的良好手段。Aβ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果不但觀察免疫反應(yīng)物的位置和形態(tài)，還具有針對(duì)性地反映了Aβ在阿爾茨海默病中的作用。但有出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能，因而必需同步設(shè)置陰性對(duì)照組、找出抗體的最佳稀釋比例、避免標(biāo)本干燥以及注意將洗滌液沖洗干凈。

綜上所述，老年斑在AD 腦的海馬及軀體運(yùn)動(dòng)區(qū)等腦區(qū)均有廣泛分布，我們通過(guò)應(yīng)用AD 轉(zhuǎn)基因小鼠證實(shí)了改良Bielshowsky鍍銀染色法與Aβ免疫組織化學(xué)染色法均可作為檢測(cè)AD 病理征老年斑的可靠方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供良好基礎(chǔ)。

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