一種基于復(fù)合空域?yàn)V波的線粒體電鏡圖像二值化增強(qiáng)算法

（福建江夏學(xué)院，福建 福州 350108）

一種基于復(fù)合空域?yàn)V波的線粒體電鏡圖像二值化增強(qiáng)算法

（福建江夏學(xué)院，福建 福州 350108）

本文通過(guò)分析線粒體電鏡圖像特點(diǎn)，提出一種基于復(fù)合空域?yàn)V波的線粒體電鏡圖像二值化增強(qiáng)算法.實(shí)驗(yàn)表明，該算法成功突出了大多數(shù)線粒體信息，抑制了大多數(shù)非線粒體信息，是進(jìn)行線粒體邊緣識(shí)別的有效圖像增強(qiáng)算法.

圖像增強(qiáng)；空域?yàn)V波；算法；線粒體

1 引言

近年，隨著高性能電子顯微鏡（以下簡(jiǎn)稱電鏡）的分辨率性能不斷提高和日趨普及，電鏡在醫(yī)學(xué)超微結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域的應(yīng)用也越來(lái)越多，各種細(xì)胞線粒體微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究方興未艾.大量的醫(yī)學(xué)研究人員在做基礎(chǔ)性研究時(shí)需借助于電鏡的幫助以獲取線粒體的超微結(jié)構(gòu)圖片，并據(jù)此進(jìn)行定量分析.然而，在獲取線粒體相關(guān)參數(shù)的方法上，目前的主要做法有兩種.一種是在人機(jī)交互下借助某個(gè)圖像分析軟件（如Imagepro）來(lái)完成，即將利用電鏡得到的數(shù)字照片輸入計(jì)算機(jī)，由有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員通過(guò)光標(biāo)在計(jì)算機(jī)屏幕上分別勾描每張照片的線粒體輪廓，從而讓圖像分析軟件獲得輪廓數(shù)據(jù)再反饋出線粒體的周長(zhǎng)、面積等參數(shù)信息[1,2].另一種是采用傳統(tǒng)的手工點(diǎn)計(jì)數(shù)法，利用自制測(cè)試格重疊于照片上測(cè)量數(shù)據(jù)，再據(jù)此計(jì)算出線粒體的體密度（Vv）、面密度（Sv）、數(shù)密度（Nv）及比表面積（δ）[3,4,5].當(dāng)研究人員為了獲得具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)論時(shí)，必須對(duì)大量的電鏡圖片進(jìn)行人工勾描，從而造成大量人力物力的耗費(fèi).為了有效解決當(dāng)前線粒體形態(tài)定量分析研究過(guò)程中，必不可少的人工識(shí)別電鏡圖片的線粒體輪廓環(huán)節(jié)極為費(fèi)時(shí)費(fèi)力這一問(wèn)題，研究尋求合適的線粒體識(shí)別算法，并最終設(shè)計(jì)出專門針對(duì)線粒體電鏡圖片進(jìn)行計(jì)算機(jī)自動(dòng)輪廓識(shí)別和給出線粒體形態(tài)定量研究常用參數(shù)的軟件，將有助于相關(guān)醫(yī)學(xué)研究人員的科研工作，提高相關(guān)醫(yī)學(xué)研究效率.

在圖像的采集、傳輸、保存、轉(zhuǎn)換過(guò)程中，由于曝光條件、光學(xué)系統(tǒng)失真、切片制作精確度、系統(tǒng)噪聲、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等因素的影響，不可避免的會(huì)導(dǎo)致原始線粒體圖像存在大量噪聲、線粒體間隙存在其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分、圖像的質(zhì)量還達(dá)不到后期自動(dòng)識(shí)別分析的要求等問(wèn)題.為了提高線粒體自動(dòng)識(shí)別的準(zhǔn)確度和降低線粒體自動(dòng)識(shí)別的誤識(shí)率、誤拒率，必須先對(duì)線粒體電鏡圖像進(jìn)行增強(qiáng)處理，目的是突出圖像中的線粒體信息，抑制非線粒體信息，從而便于計(jì)算機(jī)對(duì)圖像進(jìn)一步理解，準(zhǔn)確識(shí)別出線粒體輪廓，為最終實(shí)現(xiàn)線粒體電鏡圖像的計(jì)算機(jī)自動(dòng)識(shí)別軟件的開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ).換句話說(shuō)，設(shè)計(jì)合適的圖像增強(qiáng)處理算法是完成對(duì)線粒體電鏡圖像進(jìn)行有效線粒體輪廓自動(dòng)識(shí)別的一個(gè)重要環(huán)節(jié).目前常用的增強(qiáng)技術(shù)根據(jù)其處理所進(jìn)行的空間不同，可分為基于空域的方法和基于變換域的方法[6].基于空域的增強(qiáng)方法常用的有灰度映射、直方圖變換、空域?yàn)V波，基于變換域的方法最主要的有頻域?yàn)V波.

2 線粒體電鏡圖像特點(diǎn)

本文研究的線粒體電鏡圖像由飛利浦EM208型透射式電子顯微鏡拍攝而成，拍攝的結(jié)果直接保存為TIF格式，放大倍數(shù)大多數(shù)為12500（電鏡底片電子放大倍數(shù)是指在5X7.5 CM范圍時(shí)的放大倍數(shù)），分辨率為600DPI，顏色模式為灰度.這些線粒體圖像采集自喂養(yǎng)12周的白鼠（雄性C57B6J小鼠，體重約20-25g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）肝細(xì)胞.采集方法如下：取肝臟組織，3％戊二醛-1.5％多聚甲醛前固定，1％鋨酸-1.5％亞鐵氰化鉀后固定，乙醇-丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋劑包埋，超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，飛利浦208型透射電鏡觀察肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并采集圖像.

采集到的正常線粒體電鏡圖像（參看圖1）具有以下特點(diǎn)：

（一）電鏡圖像成分較多，線粒體較密集，正常線粒體內(nèi)部染色質(zhì)較均勻，嵴較清晰，線粒體間隙含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、豐富的糖原、少量溶酶體和脂滴.

（二）線粒體形態(tài)各異，以類橢球狀為主.圖中所有成分分布隨機(jī)，每幅圖像差異巨大.因此通過(guò)特征提取再來(lái)匹配識(shí)別線粒體的方法可行性差.

（三）圖像顏色模式是灰度.線粒體內(nèi)部部分成分與外部灰度值非常接近，而線粒體外部某些其他成分的灰度值也落在線粒體分布的主要灰度值區(qū)間.

（四）利用看圖軟件放大后觀察，可看見(jiàn)圖像中含有大量噪聲，需要在識(shí)別前進(jìn)行去噪處理.

（五）一些線粒體邊緣有些粘連、重疊.圖像中某些區(qū)域有散焦現(xiàn)象導(dǎo)致該區(qū)域各成分的邊緣較模糊.

（六）由于拍攝光源、切片厚度精確度等因素，每張圖像的亮度會(huì)有所不同，甚至一張圖像中的不同區(qū)域亮度也有可能有差異.

圖1 線粒體電鏡圖像原始圖

3 線粒體圖像增強(qiáng)算法的設(shè)計(jì)

圖像增強(qiáng)的目的是為了突出有用信息，抑制無(wú)用信息.筆者利用各常用增強(qiáng)算法在Matlab環(huán)境下對(duì)線粒體電鏡圖像進(jìn)行了大量圖像增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，可實(shí)現(xiàn)圖像平滑去噪功能的算法有：平滑濾波器（均值濾波器、中值濾波器、最大值濾波器、最小值濾波器）、頻域低通濾波器（理想低通濾波器、巴特沃斯低通濾波器、指數(shù)低通濾波器）；可實(shí)現(xiàn)增大對(duì)比度、銳化圖像功能的算法有：灰度映射、直方圖修正（直方圖均衡化、直方圖規(guī)定化）、銳化濾波器（梯度法、Laplacian算子法、Sobel算子法）、頻域高通濾波器（理想高通濾波器、巴特沃斯高通濾波器、指數(shù)高通濾波器）.此外，帶通或帶阻濾波器根據(jù)設(shè)置的通帶寬度W，通帶中心頻率D0的值，可能實(shí)現(xiàn)平滑圖像功能，也可能實(shí)現(xiàn)銳化圖像功能；同態(tài)濾波器可消除乘性噪聲和增強(qiáng)圖像對(duì)比度.

對(duì)于線粒體電鏡圖像而言，有用的信息即線粒體邊緣，其余其他成分均可看作無(wú)用的干擾信息.線粒體圖像增強(qiáng)處理的主要目的即突出線粒體邊緣，消除或抑制其他成分（包括圖像中的噪聲），以利于提高后續(xù)的線粒體邊緣識(shí)別操作的正確率.而隨著圖像采集和處理方法的進(jìn)步，前人已研究和提出針對(duì)各種不同特性圖像的增強(qiáng)技術(shù)，但是這些增強(qiáng)算法由于任何一種圖像增強(qiáng)算法僅能對(duì)某類型圖像有效，所以無(wú)法實(shí)現(xiàn)通用性.就筆者對(duì)線粒體電鏡圖像進(jìn)行的各常用圖像增強(qiáng)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，現(xiàn)有增強(qiáng)算法雖然大多數(shù)對(duì)線粒體電鏡圖像有一定增強(qiáng)效果，但是還沒(méi)有一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果足以滿足后續(xù)線粒體邊緣識(shí)別的正確率要求.為此，在比較研究常用圖像增強(qiáng)算法的線粒體電鏡圖像增強(qiáng)處理的優(yōu)劣基礎(chǔ)上，特設(shè)計(jì)一種復(fù)基于復(fù)合空域?yàn)V波的二值化增強(qiáng)算法以符合線粒體電鏡圖像邊緣識(shí)別需求，該增強(qiáng)算法如下:

step1:讀入測(cè)試圖像，將圖像信息賦予圖像二維矩陣變量I；

step2:定義二維矩陣變量 J、K、G、GB，定義變量M和N分別用于保存I的二個(gè)維數(shù)，即圖像像素的垂直排列個(gè)數(shù)和水平排列個(gè)數(shù)；

step3:定義閾值變量yuzhi1，并賦予值20；

step4:設(shè)置二重循環(huán)，除去圖像四周最外一圈的像素點(diǎn)，遍歷所有內(nèi)部像素點(diǎn),對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)執(zhí)行操作a）-c），得到一種初步二值化圖像，效果圖如圖2（b）所示，其中邊緣像素點(diǎn)顯示為白色，其余部分像素點(diǎn)顯示為黑色；

a）設(shè)置標(biāo)志變量flag=0；

b）對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)，分別計(jì)算其鄰域的八個(gè)像素點(diǎn)灰度值與自身灰度值之差，如果該差值小于yuzhi1，則 flag累加 1；

c）如果flag小于3個(gè)或者大于5個(gè)，則設(shè)置J（i,j）=0；其他情況，設(shè)置 J（i,j）=255；

step5:設(shè)置二重循環(huán)，除去圖像四周最外一圈的像素點(diǎn)，遍歷所有內(nèi)部像素點(diǎn),對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)執(zhí)行操作a）-c）,得到一種有一定去噪效果的邊緣銳化增強(qiáng)圖K，效果圖如圖2（c）所示；

a）計(jì)算像素點(diǎn)I（i,j）的八鄰域像素點(diǎn)的灰度值的和 sum I；

b）計(jì)算像素點(diǎn)J（i,j）的八鄰域像素點(diǎn)的灰度值的和sumJ；

c）計(jì)算 K（i,j）=（sum I+sumJ+4*J（i,j））/20，其中給予J（i,j）4倍權(quán)值，使得線粒體區(qū)域比其他區(qū)域的顏色加深效果更明顯，從而提高線粒體與背景圖像的區(qū)分度;

step6:設(shè)置閾值變量yuzhi2=40；

step7:設(shè)置二重循環(huán)，除去圖像四周最外五圈的像素點(diǎn)，遍歷其余內(nèi)部像素點(diǎn),對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)執(zhí)行操作a）-c）,得圖K的一種去噪平滑圖G，效果圖如圖 2（d）所示；

a）設(shè)置表示距離的變量d=5；

b）計(jì)算與K（i,j）距離為d的八個(gè)方向上的八個(gè)像素點(diǎn)的灰度平均值賦予變量ave；

c）如果K（i,j）與ave的差值的絕對(duì)值大于yuzhi2，則 G（i,j）=ave;

step8:設(shè)置 K=G，yuzhi2=20；重復(fù)步驟 7），得到一種二次去噪平滑圖G，此時(shí)原始線粒體電鏡圖像中的噪聲已幾乎去除干凈，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原、溶酶體和脂滴已完全與背景混為一體，以淺灰色為主，線粒體以深灰色為主，效果如圖2（e）所示.

step9:計(jì)算圖G的平均灰度aveHD；

step10:設(shè)置修正值變量xzz=8；

step11:設(shè)置二重循環(huán)，除去圖像四周最外五圈的像素點(diǎn)和左側(cè)前40列像素點(diǎn)，遍歷其他內(nèi)部像素點(diǎn),對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)執(zhí)行操作a）-c）,得到一種二值化增強(qiáng)圖GB，效果圖如圖2（f）所示；

a）計(jì)算像素點(diǎn)G（i,j）的自身及八鄰域像素點(diǎn)的平均灰度值aveG；

b）設(shè)置p=i-4;q=j-40;；

c）如果aveG

以上算法step11中，由于原始圖像的最左側(cè)含有圖像標(biāo)題信息，在step7中距離設(shè)置為5，未處理圖像最外五圈像素，所以以上區(qū)域無(wú)法進(jìn)行充分的增強(qiáng)處理，在最終增強(qiáng)圖像中予以裁剪去除.若對(duì)以上算法中的閾值變量yuzhi1、閾值變量yuzhi2、修正值變量xzz、距離變量d的值進(jìn)行變更，最終增強(qiáng)效果將相應(yīng)有所改變.采用yuzhi1=20、yuzhi2=40、xzz=8、d=5，得到的最終二值化的增強(qiáng)圖的過(guò)程如圖2所示.

4 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，最終的二值化增強(qiáng)圖中已將所有線粒體的區(qū)域大部分設(shè)置為黑色，非線粒體區(qū)域大部分被設(shè)置為了白色，達(dá)到了突出線粒體信息和抑制非線粒體信息的增強(qiáng)目的，故該二值化增強(qiáng)的結(jié)果基本符合后續(xù)線粒體輪廓識(shí)別需要.但是原始圖像中有些模糊、灰度值與鄰域差距不大的小部分非線粒體區(qū)域的像素點(diǎn)也被處理成了黑色，這需要在后續(xù)邊緣識(shí)別算法中予以甄別去除.此外二值化增強(qiáng)后的線粒體輪廓存在“鋸齒”現(xiàn)象，需要在邊緣識(shí)別過(guò)程中予以消除，以確保之后的線粒體定量分析中計(jì)算線粒體平均周長(zhǎng)的精確性.

圖2 生成二值化增強(qiáng)圖過(guò)程

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A

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福建省教育廳B類科技項(xiàng)目（JB11190）