alpha-晶體蛋白在氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變中的表達(dá)

石 怡，李筱榮，汪建濤，劉新玲

（天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心眼底病科，天津300384）

alpha-晶體蛋白（α-crystallin）屬于小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins,sHSPs）家族，其在應(yīng)激反應(yīng)中維持細(xì)胞必需的蛋白質(zhì)構(gòu)象，而且在蛋白質(zhì)聚集折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、移位、細(xì)胞骨架穩(wěn)定等方面均發(fā)揮重要的功能。在最近的基因芯片和蛋白質(zhì)組研究中，越來越多的研究表明晶體蛋白不僅在正常視網(wǎng)膜，在糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜變性等視網(wǎng)膜疾病中也有表達(dá)，這提示晶體蛋白在視網(wǎng)膜中功能的重要性[1]。視網(wǎng)膜新生血管是多種視網(wǎng)膜病變增殖期的標(biāo)志性改變，對其發(fā)病機(jī)制的研究始終是眼底病研究的焦點(diǎn)。本研究建立小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型，明確視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生發(fā)展,研究alphaA-和alphaB-晶體蛋白mRNA在小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜組織中變化的規(guī)律，并行免疫熒光方法檢測其在該視網(wǎng)膜組織中的定位分布特點(diǎn)，擬為進(jìn)一步研究alpha-晶體蛋白在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中與新生血管發(fā)生之間關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級C57BL/6J小鼠，購自北京中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物室繁殖健康幼鼠，雌雄不限，與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，室溫保持（23±2）℃，光照 300lux，光照與黑暗12 h/12 h飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 醫(yī)用80%氧氣和20%氮?dú)饣旌蠚怏w（天津市盛益源醫(yī)用氣體公司）。異硫氰酸葡聚糖熒光素（美國Sigma公司），alphaA-crystallin（FL-173）和 alphaB-crystallin（FL-175）)/Rabbit（美 國Santacoz公司），GoatantiRabbit IgG（H+L）-FITC（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TrizolReagent（美國Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型的建立 清潔級初生C57BL/6J小鼠14窩。出生后3 d（P3）合籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組參照Pierce等的方法，出生后7 d（P7）時(shí)將小鼠放入氧濃度為（75±5）%的飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng) 5 d，溫度為（23±2）℃ ，氧氣分析儀（BioSperix）檢測并調(diào)控箱內(nèi)氧氣濃度，每天打開氧箱更換墊料、加食、換水、替換母鼠，出生后12 d（P12）回到正常大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。另設(shè)等量對照組小鼠，置于正常大氣中飼養(yǎng)，余同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 熒光素灌注視網(wǎng)膜鋪片 于出生后13、17和21 d時(shí)各取實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠眼球4只，幼鼠乙醚麻醉，固定四肢，打開胸腔，暴露心臟，取異硫氰酸葡聚糖熒光素溶液1mL（50mg/L），心腔內(nèi)注射。制作熒光素灌注視網(wǎng)膜鋪片：將小鼠處死后立即摘除眼球，4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定1~3 h染色。制作視網(wǎng)膜鋪片，于角鞏膜緣剪開眼球去除前節(jié)，小心分離視網(wǎng)膜，放射狀切開視網(wǎng)膜后將其平鋪于載玻片上，滴少量中性樹脂膠后，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察血管分布和形態(tài)，數(shù)碼照相機(jī)拍片記錄結(jié)果。

1.2.3 Real time RT-PCR實(shí)驗(yàn) 各取實(shí)驗(yàn)組及對照組小鼠，分別收集P13、P15、P17和P21等不同時(shí)點(diǎn)的小鼠眼球各9只，在手術(shù)顯微鏡下摘取眼球，每只眼球去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網(wǎng)膜組織，提取3個(gè)視網(wǎng)膜組織放入1mL Trizol液（美國Invitrogen公司）中，所有樣本放置在-80℃保存。采用Trizol一步法提取視網(wǎng)膜總RNA。取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，應(yīng)用熒光定量PCR分析alphaA-和alphaB-晶體蛋白的相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。設(shè)計(jì)引物如下：alphaA-晶體蛋白上游引物：TCACCGTGAAGGTACTGGA，下游引物：TCACCGTGAAGGTACTGGAGG，擴(kuò)增片段為111堿基對。alphaB-晶體蛋白上游引物：TCCACGGCAAGCACGAAG，下游引物：GACAGGGATGAAGTGATGGTGAG，擴(kuò)增片段115堿基對。β-actin上游引物：AGAGGGAAATCGT GCGTGAC，下游引物：AGGCAGCTCATAGCTCTTCT CC，擴(kuò)增片段116堿基對。引物委托南開大學(xué)泰達(dá)學(xué)院生物技術(shù)有限公司合成。PCR循環(huán)條件為預(yù)變性 95℃10 s，變性 95℃15 s，退火+延伸 60~95℃30 s。變性、退火、延伸重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每一次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將得到的對照組和實(shí)驗(yàn)組CT數(shù)據(jù)分別于各自內(nèi)參分析處理后，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算各時(shí)點(diǎn)alphaA-和alphaB-晶體蛋白mRNA表達(dá)水平的倍數(shù)值并進(jìn)行比較。

1.2.4 兩種alpha-晶體蛋白免疫熒光實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組與對照組分別取各組出生后13、15、17和21 d時(shí)4只新生小鼠眼球，每只眼球去除晶狀體組織，后予OCT固定眼球并標(biāo)記方向。切片方向平行于角膜至視乳頭的矢狀位，取新鮮去除晶狀體眼球組織做6μm冰凍切片，5%牛血清封閉液封閉30min傾去。滴加特異性抗體alphaA-crystallin（FL-173）和alphaB-crystallin（FL-175）各 1∶50 稀釋覆蓋組織 4 ℃過夜孵育；轉(zhuǎn)天緩至室溫20 min，放置37℃孵育1 h；滴加熒光二抗 GoatantiMouse IgG（H+L）-FITC 1∶20稀釋37℃孵育1 h。50%甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料均以表示。當(dāng)方差齊時(shí)，組間比較采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)；當(dāng)方差不齊時(shí)，采用近似F檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光灌注小鼠視網(wǎng)膜鋪片 小鼠視網(wǎng)膜熒光灌注（高分子FITC灌注）鋪片實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，13 d時(shí)，對照組視網(wǎng)膜尚未發(fā)育完全，血管自視盤發(fā)出，向四周呈放射狀均勻分布，管徑較粗，分支可，尚有未成熟血管（圖1-A）；實(shí)驗(yàn)組自視盤發(fā)出的視網(wǎng)膜血管充盈迂曲，分布輕度紊亂，分支減少，走行僵直，仍見殘留的玻璃體動(dòng)脈，中央部視網(wǎng)膜可見無灌注區(qū)，周邊部視網(wǎng)膜仍可見部分小血管結(jié)構(gòu)，僅有視網(wǎng)膜淺層存在新生血管，深層未見明顯的視網(wǎng)膜血管形成（圖1-D）。

17 d時(shí)，對照組小鼠視網(wǎng)膜血管基本成熟，未成熟血管消失，自視盤發(fā)出的大血管向四周呈放射狀均勻分布，直至視網(wǎng)膜周邊部，有些在周邊部仍較粗，形成沿周邊部視網(wǎng)膜走行的弓形血管，周邊部尚無正常血管。全部視網(wǎng)膜血管分深淺兩層，淺層血管呈放射狀分支形態(tài)，深層血管呈多角形網(wǎng)狀形態(tài)，兩層血管通過螺旋血管互相連接（圖1-B）。實(shí)驗(yàn)組自視盤發(fā)出的視網(wǎng)膜血管更加擴(kuò)張、迂曲，有大量新生血管形成，血管密度更加增高，但這些新生血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)及分布極其紊亂，喪失了正常的放射狀及多角形結(jié)構(gòu)，幼鼠中可見較多的突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，周邊部可見滲漏（圖1-E），而且淺層血管網(wǎng)及大部分深層血管網(wǎng)廣泛閉塞。雖然與人類ROP的灌注區(qū)位于中央部視網(wǎng)膜、無灌注區(qū)位于周邊部視網(wǎng)膜不同，但是新生血管的分布都是在視網(wǎng)膜的中周部。

21 d時(shí)，對照組較17 d時(shí)視網(wǎng)膜血管已完全長到周邊部，其他兩時(shí)間點(diǎn)間無明顯差異（圖1-C）；實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜中周邊部仍可見無灌注區(qū)，但新生血管明顯減少，滲漏消失（圖1-F）。

2.2 real time RT-PCR結(jié)果 各組內(nèi)參照β-actin的表達(dá)量較均衡。實(shí)驗(yàn)組alphaA-晶體蛋白mRNA的表達(dá)為先降低后升高的趨勢，P17時(shí)表達(dá)量抵谷，與其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=220.378，P<0.01）；實(shí)驗(yàn)組alphaA-晶體蛋白表達(dá)在P13、P15及P21時(shí)均高于對照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=54.223，15.947，12.998，P<0.01），實(shí)驗(yàn)組alphaA-晶體蛋白表達(dá)在P17時(shí)低于對照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.357，P<0.01）（圖 2）。

實(shí)驗(yàn)組alphaB-晶體蛋白mRNA的表達(dá)則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.895，P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間兩兩比較，13 d時(shí)均低于17 d及21 d時(shí)，P17時(shí)低于21 d時(shí)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=56.31，137.362，94.708，P<0.01），實(shí)驗(yàn)組其余時(shí)間點(diǎn)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.831，0.606，0.048，P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組 alphaB-晶體蛋白表達(dá)在13、15及17 d時(shí)均低于對照組，其中13、17 d時(shí)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.309，31.915，12.998，P<0.01），但P15時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.630，P＞0.05），在 21 d 時(shí)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.544，P<0.05）（圖 3）。

2.3 alpha-晶體蛋白在兩組小鼠視網(wǎng)膜組之中的定位 實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠視網(wǎng)膜組織中，均可見alphaA-和alphaB-晶體蛋白的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)、外核細(xì)胞層，少量表達(dá)在視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層。這兩種晶體蛋白都是在內(nèi)核細(xì)胞層中不僅表達(dá)在胞膜上而且還表達(dá)在胞質(zhì)中，但在外核細(xì)胞層中卻僅表達(dá)在胞膜上。實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠視網(wǎng)膜組織中，可見alphaA-和alphaB-晶體蛋白的表達(dá)稍有不同。其在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)稍延遲于同時(shí)間兩種蛋白的mRNA的表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠視網(wǎng)膜組織中，實(shí)驗(yàn)組alphaA-晶體蛋白的表達(dá)略多于對照組，見圖4。

實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠視網(wǎng)膜組織中,alphaB-晶體蛋白的表達(dá)也稍有不同，呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，見圖5。

3 討論

近年來，在許多動(dòng)物的視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)了晶體蛋白的表達(dá)，而且其非晶體角色已被接受，并表達(dá)在許多組織中[2-3]。晶體蛋白表達(dá)在這些完全不同的非晶體組織中，盡管其分布不完全相同，但仍保持相同的作用機(jī)制，均可在熱及代謝性應(yīng)激條件下起到保護(hù)細(xì)胞的作用，而且它們通過酶抑制細(xì)胞凋亡的作用暗示這兩種晶體蛋白在非晶體組織中可起到?jīng)Q定性作用[4-5]。

本研究中采用的是C57BL小鼠，其視網(wǎng)膜血管與人類有諸多相似之處，如以視盤為中心，呈放射狀展開，視網(wǎng)膜血管網(wǎng)分為淺層和深層，初生時(shí)視網(wǎng)膜血管尚未發(fā)育完全等，因此成為研究血管發(fā)育和新生血管等的良好模型。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用的是smith法氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的小鼠模型，新生嚙齒動(dòng)物P7暴露在高氧環(huán)境5 d后回到正常氧環(huán)境。在正常氧環(huán)境下視網(wǎng)膜相對缺氧，刺激細(xì)胞因子引起視網(wǎng)膜新生血管，這是一種常用的成熟的視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用FITC-Dextran灌注技術(shù)觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)，驗(yàn)證視網(wǎng)膜新生血管動(dòng)物模型的新生血管的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究實(shí)驗(yàn)組alphaA-晶體蛋白mRNA的表達(dá)為先降低后升高的趨勢，P17時(shí)表達(dá)量抵谷，P21時(shí)達(dá)峰；alphaB-晶體蛋白mRNA的表達(dá)則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,P13時(shí)均低于P17及P21時(shí)，P17時(shí)低于P21時(shí)。本研究中alphaA-晶體蛋白mRNA表達(dá)水平在形成新生血管的過程中，呈現(xiàn)下降趨勢，在新生血管形成過程逐漸減少，可能參與抑制新生血管的形成，在新生血管形成及達(dá)到高峰后，這種晶體蛋白mRNA表達(dá)水平又明顯升高，推測其對視網(wǎng)膜組織具有一定的保護(hù)作用，對抗缺氧對視網(wǎng)膜組織的損傷，在抑制細(xì)胞凋亡方面起到作用。Alpha-晶體蛋白已被證實(shí)其主要功能是結(jié)合未折疊蛋白、抑制其聚結(jié)、防止其變性降解，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[6]；一些熱休克蛋白還可通過選擇性抑制線粒體凋亡，從而抑制caspase-9（線粒體通路）和caspase-8（死亡受體通路）對caspase-3的激活，起到抗凋亡的作用[7，9]；另外還可通過阻止RAS的激活抑制ERKl-2的活性，從而大大減輕Ca2+誘導(dǎo)引起的凋亡作用[10]。

另有實(shí)驗(yàn)證明alpha-晶體蛋白能抑制介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、光感受器細(xì)胞以及晶狀體上皮細(xì)胞的損傷過程中發(fā)揮重要作用[11]。通過建立H2O2損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的模型[12]，實(shí)驗(yàn)觀察到alpha-晶體蛋白處理組細(xì)胞存活率明顯高于損傷對照組，說明alpha-晶體蛋白對損傷后RGCs存活的保護(hù)作用顯著，是RGCs耐受氧化損傷的保護(hù)物質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠視網(wǎng)膜組織中，alphaA-和alphaB-晶體蛋白的定位表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)、外核細(xì)胞層，少量表達(dá)在視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層。這兩種晶體蛋白都是在內(nèi)核細(xì)胞層中不僅表達(dá)在胞膜上而且還表達(dá)在胞質(zhì)中，但在外核細(xì)胞層中卻僅表達(dá)在胞膜上，與2003年Xi等[13]的初步研究基本一致，其發(fā)現(xiàn)在正常小鼠視網(wǎng)膜中有20種不同晶體蛋白基因的表達(dá)，其中在視網(wǎng)膜外核和內(nèi)核層可見alpha-晶體蛋白的表達(dá)，光感受器內(nèi)節(jié)可見alpha-晶體蛋白的表達(dá)。同時(shí)符合最新研究報(bào)道，其描述alphaA-晶體蛋白在早期實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性色素膜炎病變的視網(wǎng)膜組織中增量表達(dá)[14]，提示其存在抗凋亡作用。本研究不僅再一次證明這種晶體蛋白在正常小鼠視網(wǎng)膜的定位表達(dá)，而且首次研究出這種晶體蛋白在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠中的定位表達(dá)，為進(jìn)一步明確alpha-晶體蛋白與視網(wǎng)膜新生血管及氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變的關(guān)系提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究明確在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜組織中，alpha-晶體蛋白在視網(wǎng)膜組織中表達(dá)具有時(shí)空依賴性，alpha-晶體蛋白對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠的視網(wǎng)膜組織可能具有保護(hù)作用，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。由于經(jīng)費(fèi)條件限制，本實(shí)驗(yàn)未能通過miRNA技術(shù)消除alpha-晶體蛋白進(jìn)行對照研究，擬今后實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善。本研究推測alpha-晶體蛋白對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠的視網(wǎng)膜組織可能具有保護(hù)作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]Yaung J,Kannan R,Wawrousek E F,etal.Exacerbation of retinal degeneration in the absence of alpha-crystallin in an in vivomodel ofchemically induced hypoxia[J].Exp Eye Res,2008,86（2）：355

[2]McGreal R S,Lee Kantorow W,Chauss D C,et al.αB-crystallin/sHSP protects cytochrome c and mitochondrial function againstoxidative stress in lensand retinal cells[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820（7）：921

[3]ZhuW,QiX,Ren S,etal.αA-crystallin in the pathogenesisand intervention ofexperimentalmurine cornealneovascularization[J].Exp EyeRes,2012,98（1）：44

[4]Wolf L,Yang Y,Wawrousek E,etal.Transcriptional regulation of mouse alpha A-crystallin gene in a 148kb Cryaa BAC and its derivates[J].BMCDev Biol,2008,19（8）：88

[5]RaoN A,Saraswathy S,Pararajasegaram G,etal.Smallheatshock proteinαA-crystallin prevents photoreceptor degeneration in experimentalautoimmuneuveitis[J].PLoSOne,2012,7（3）：e33582

[6]Ahmad M F,Ranman B,Ramakrishna T,eta1.Effectofphosphorylation on alpha B-crystallin：differences in stability,subunit exchange and chaperone activity of homo and mixed oligomers of alphaB-crystallin and its phosphory-lation-mimickingmutant[J].J MolBiol,2008,375（4）：1040

[7]Andley UP,Song Z,Wawrousek E F,eta1.Differentialprotective activity of alpha A-and alpha B-crystallin in lens epithelial cells[J].JBiolChem,2000,275（47）：36823

[8]KamradtM C,Chen F,Sam S,eta1.The smallheatshock protein alpha B-crystallin negatively regulates apoptosis during myogenic differentiation by inhibiting caspase-3 activation[J].JBiol Chem,2002,277（41）：38731

[9]Kamradt M C,Chen F,Cryns V L.The small heat shock protein alphaB-crystallin negatively regulates cytochromec-and caspase-8-dependent activation of caspase-3 by inhibiting its autoproteolyticmaturation[J].JBiolChem,2001,276（191）：16059

[10]Li D W,Liu J P,Mao Y W,et a1.Calcium-activated RAF／MEK／ERK signaling pathwaymediates p53-dependent apoptosis and is abrogated by alphaB-crystallin through inhibition of RAS activation[J].MolBiolCell,2005,16（9）：4437

[11]Maddala R,Rao V P.Alpha-crystallin localizes to the leading edges ofmigrating lensepithelial cells[J].Exp Cell Res,2005,306（1）：203

[12]王曉芹，王一.alpha-晶體蛋白干預(yù)大鼠RGCs過氧化損傷作用實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2006，10，35（19）：1764

[13]Xi J,Farjo R,Yoshida S,et al.A comprehensive analysis of the expression of crystallins inmouse retina[J].Mol Vis,2003,28（9）：410

[14]Rao N A,Saraswathy S,Wu G S,et al.Elevated retina-specific expression of the smallheatshock protein,alphaA-crystallin,isassociated with photoreceptor protection in experimental uveitis[J].InvestOphthalmolVisSci,2008,49（3）：1161