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    血管性癡呆大鼠海馬DG區(qū)幾種氨基酸含量的變化

    2012-10-18 06:37:58元藝蘭樸虎男崔松彪
    卒中與神經(jīng)疾病 2012年6期
    關(guān)鍵詞:探針海馬氨基酸

    元藝蘭 樸虎男 吳 光 崔松彪

    血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由一系列腦血管因素(包括腦缺血、腦出血或急慢性缺血缺氧性腦血管病等),導(dǎo)致腦組織損害而引起的,以記憶、認(rèn)知功能障礙為特征的獲得性智能損害綜合征。它具有發(fā)病率較高、致殘率較高等特點(diǎn),但也是老年期癡呆中僅有的可預(yù)防和治療的一種癡呆[1]。目前為止,雖然很多臨床資料和基礎(chǔ)研究證明VD的發(fā)病與腦血管疾病、動脈粥樣硬化、高血壓病、糖尿病、肥胖、代謝綜合征、心臟病、高纖維蛋白原血癥、高血粘度、長期吸煙酗酒等諸多因素有關(guān),而且還和病灶的性質(zhì)也密切相關(guān)[2,3],但其發(fā)病的確切機(jī)制尚不完全清楚。因此,為了初步探討與VD記憶認(rèn)知障礙相關(guān)的海馬區(qū)神經(jīng)化學(xué)機(jī)制,本研究以雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎的方法制備VD模型大鼠,并以在大鼠空間學(xué)習(xí)記憶中起關(guān)鍵作用的海馬齒狀回(Dentate gyrus,DG)區(qū)為研究對象,利用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察了細(xì)胞外液中幾種氨基酸類神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量變化。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)采用清潔級Wistar系雄性大鼠,體重在250~300克,由吉林大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

    1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分成3組:對照組6只,不作手術(shù);假手術(shù)組6只,剝離雙側(cè)頸總動脈,但不結(jié)扎;模型組6只(VD組):剝離雙側(cè)頸總動脈,并進(jìn)行永久性結(jié)扎。

    1.3 VD大鼠模型的制備 經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn),我們采用改良的雙側(cè)血管阻斷(2-VO)法[4]來建立 VD大鼠模型。具體操作為選取健康雄性wistar大鼠,手術(shù)前禁食不禁水8~12 h,腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行麻醉,待大鼠深度麻醉后將大鼠仰臥固定,頸部皮膚剃毛備皮,并進(jìn)行碘伏酒精常規(guī)消毒;于頸部正中央切口,鈍性剝離皮下組織,在切口正下方的胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌的交界處(即Y形溝內(nèi))可以找到手觸之有搏動感、粉紅色較粗大血管,即頸總動脈;小心剝離出一側(cè)頸總動脈后,采用4號手術(shù)線結(jié)扎;以青霉素粉于局部傷口處處理,縫合傷口;7 d后同樣方法進(jìn)行另一側(cè)頸總動脈結(jié)扎。假手術(shù)組只做剝離不結(jié)扎,對照組不做剝離手術(shù)。VD組和假手術(shù)組,兩組手術(shù)大鼠術(shù)后單獨(dú)籠養(yǎng)1周后合籠飼養(yǎng)。

    1.4 行為學(xué)檢測 采用Morris水迷宮系統(tǒng),該系統(tǒng)包括一個(gè)直徑130 cm、高50 cm的圓形水池,一個(gè)水中平臺和懸掛在水池上端的記錄裝置三部分(圖1);實(shí)驗(yàn)水深30 cm,水溫(20±2)℃;池壁上標(biāo)有4個(gè)對稱的入水點(diǎn),分為東、南、西、北,并以此為中心將水池分為4個(gè)象限,選其中任一象限中央放置平臺,平臺及整個(gè)水池內(nèi)部漆成黑色;平臺高度為28 cm,直徑為10cm,使平臺距水平面1.5~2.5 cm;水迷宮上方的攝像頭用來隨時(shí)記錄大鼠的運(yùn)動軌跡;整個(gè)訓(xùn)練期間水迷宮外各種布置保持不變,訓(xùn)練時(shí)光源等應(yīng)一致,保持周圍環(huán)境安靜;造模前和造模30 d后各進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練和檢測1次,用來評估手術(shù)前后大鼠學(xué)習(xí)記憶改變;每次訓(xùn)練開始前1 d,為了讓大鼠熟悉環(huán)境,讓大鼠在水池中自由游泳3 min,此時(shí)撤出平臺;為了評估大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力,我們進(jìn)行大鼠定位航行實(shí)驗(yàn),設(shè)定為每天訓(xùn)練4次,第5次進(jìn)行測試,共需5 d完成;將大鼠從入水點(diǎn)背向水池中央放置,記錄60 s內(nèi)大鼠從入水到爬上平臺所需的時(shí)間,即逃避潛伏期;有的大鼠在60 s內(nèi)能夠找到平臺,讓其在平臺上站立10 s,有的大鼠找不到,將大鼠引上平臺,并讓其停留10 s,此時(shí)潛伏期記為60 s。

    圖1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測系統(tǒng)

    1.5 海馬區(qū)微量透析探針及其外套管固定手術(shù)

    大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,待大鼠完全麻醉后頭部去毛備皮,將大鼠腹臥位固定于立體腦定位儀上;根據(jù)Paxinos和Watson所繪制的大鼠腦圖譜,將透析探針外套管插入到DG區(qū);DG區(qū)定位以前囟為參考點(diǎn),后退3.1~3.3 mm,旁開(左右皆可)1.9~2.1mm,深度為高于DG區(qū)1.5 mm的位置,然后用牙托粉將其固定在大鼠顱骨上;術(shù)后把大鼠放在長30 cm,寬30 cm,高35 cm的實(shí)驗(yàn)用不透明的塑料小箱中飼養(yǎng);第2 d大鼠狀態(tài)恢復(fù)后經(jīng)外套管將透析探針插入到海馬DG區(qū),用蠟將探針固定在外套管上,探針超出外套管1.5 mm(前端附有半透膜),待大鼠安靜后進(jìn)行腦部微量透析實(shí)驗(yàn);微量透析探針及其外套管埋入(圖2)。

    圖2 微量透析探針及其外套管的埋入位置模式圖

    1.6 微量透析樣本的收集和氨基酸含量的測定 根據(jù)Jin等的方法[5],微量透析探針連接微量泵,向大鼠海馬DG區(qū)灌流Ringer’s液,流速為1.5μL/min,待穩(wěn)定90 min后開始進(jìn)行樣本收集,每管收集量為15 μL,收集10min,保存在-80℃冰箱,以備進(jìn)行氨基酸含量分析;每只大鼠收集3個(gè)管,取其平均值;氨基酸含量測定采用高效液相色譜和電化學(xué)檢測系統(tǒng)(ECD-300),取12μL樣本和4mM 的 OPA 溶液3 μL,混勻在室溫下反應(yīng)2.5 min,抽取上述溶液10μL,通過手動進(jìn)樣口注入到系統(tǒng)中進(jìn)行分析,其參數(shù)為流動液流速:0.5 mL/min,壓力<10 Mp。

    1.7 組織學(xué)鑒定 待樣本收集完后將大鼠麻醉處死,小心剝離腦組織,固定在10%甲醛溶液中,采用連續(xù)手動冰凍切片法做厚度為60μm的腦切片,干燥1 d后即可在顯微鏡下觀察。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)表示,采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 VD模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

    造模前對照組、假手術(shù)組和VD組大鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加逐漸縮短,各組間無顯著性差異(表1)。造模30 d后對照組和假手術(shù)組與造模前相似,其逃避潛伏期也隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而明顯減小,而VD組的逃避潛伏期雖然也有隨訓(xùn)練天數(shù)而減小的傾向,但減小幅度緩慢,與對照組和假手術(shù)組相比較有顯著性差異(表2)。

    2.2 組織學(xué)鑒定

    根據(jù)Paxinos & Waston的大鼠腦圖譜,對腦切片標(biāo)本進(jìn)行了組織學(xué)鑒定。圖3是一張典型的組織學(xué)顯微鏡照片,圖中透析探針位于海馬DG區(qū)。定位不準(zhǔn)確者不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

    表1 造模前各組大鼠逃避潛伏期的比較(s)

    表2 造模30 d后各組大鼠逃避潛伏期的比較(s)

    圖3 微量透析探針位置標(biāo)記圖

    2.3 VD模型大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中幾種氨基酸含量的變化

    假手術(shù)組與對照組比較,7種氨基酸的含量均無明顯變化(P均>0.05);VD組與對照組及假手術(shù)組比較,Gln、Tau、Ala和GABA的含量明顯增加(P均<0.01),而Asp、Glu和Gly的含量沒有明顯差異(P均>0.05)(表3)。

    表3 各組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的氨基酸含量(用高效液相色譜圖上的波形所占面積表示)

    3 討 論

    VD是因腦血管疾病所致的癡呆,在我國是老年期癡呆的主要類型,對它的研究和認(rèn)識成為人們?nèi)找骊P(guān)注的熱點(diǎn)。海馬是機(jī)體完成學(xué)習(xí)記憶活動的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),海馬區(qū)的包括氨基酸類在內(nèi)的多種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)參與學(xué)習(xí)記憶功能。有研究指出,VD的記憶認(rèn)知障礙和海馬區(qū)的病理變化密切相關(guān)[6-9],然而對于VD記憶認(rèn)知障礙和海馬區(qū)氨基酸類物質(zhì)含量的關(guān)系目前報(bào)道罕見。VD大鼠模型的制備方法比較多,有3血管閉塞法、4血管阻斷法、急性大腦中動脈梗 死 法、雙 側(cè) 頸 總 動 脈 結(jié) 扎 法 等[4,10,11]。 經(jīng)過反復(fù)的預(yù)實(shí)驗(yàn),我們采用了改良的雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法,即在實(shí)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法的時(shí)候,將兩側(cè)頸總動脈結(jié)扎間隔延長為1周,而且在術(shù)后1 d內(nèi)將大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。此方法制備VD模型,動物存活率較高,而且模型的成功率也大大提高。

    血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是腦血管病的病灶涉及額葉、顳葉及邊緣系統(tǒng),或病灶損害了足夠容量的腦組織,導(dǎo)致記憶、注意、執(zhí)行功能和語言等高級認(rèn)知功能的嚴(yán)重受損。隨著近幾年各種科學(xué)技術(shù),尤其是生物技術(shù)研究手段的發(fā)展,VD的發(fā)病機(jī)制的研究取得了一些進(jìn)展,但到目前為止仍然沒有對VD的發(fā)病機(jī)制有一個(gè)完整的闡述。本實(shí)驗(yàn)以改良的雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備VD模型,并采用微量透析法和高效液相色譜法測定了清醒大鼠海馬DG區(qū)7種氨基酸(包括Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、Ala和GABA)的含量,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VD模型大鼠海馬DG區(qū)Gln、Tau、Ala和GABA含量明顯增加。

    腦內(nèi)Glu代謝的前體物質(zhì)是Gln,因此Gln對腦功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用可能是通過Glu遞質(zhì)系統(tǒng)起效的,也有研究報(bào)道,在腦片培育實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)Gln可以產(chǎn)生海馬穿通通路纖維中80%的Glu[12]。因?yàn)橐郧皩τ贕ln的營養(yǎng)學(xué)研究主要集中于其對創(chuàng)傷、感染、手術(shù)等急性應(yīng)激狀態(tài)下的腸內(nèi)外營養(yǎng)支持。近年研究表明,Gln可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能來治療記憶障礙這一腦出血后遺癥,同時(shí)也可以促進(jìn)兒童的智力發(fā)育,尤其是智力發(fā)育不全的兒童效果更佳,并且還參與治療帕金森氏綜合征和防止癜癇間發(fā)作[13]。Tau是一種能增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用的必需氨基酸,這歸功于其能促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育、增殖分化的作用;Tau增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力最初啟動的腦區(qū)可能是顳葉皮層、海馬、下丘腦和丘腦等區(qū)域,而且它還參與細(xì)胞間的信息傳遞[14]。有研究報(bào)道,在清醒大鼠學(xué)習(xí)記憶活動過程中海馬DG區(qū)的Gln和Tau明顯增加,提示Gln和Tau可能參與海馬DG區(qū)的學(xué)習(xí)記憶功能活動中[6]。本研究結(jié)果顯示VD模型大鼠海馬DG區(qū)Gln和Tau含量增加,但卻伴有學(xué)習(xí)記憶水平的下降,提示VD記憶障礙中可能出現(xiàn)Tau和Gln的代償性增加,但也不能排除兩者作為VD記憶障礙產(chǎn)生原因的可能性。另外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,VD模型大鼠DG區(qū)的Gln含量增加并沒有伴有Glu濃度的變化,其可能的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

    Ala和Gly都是人體中重要的抑制性氨基酸。它分子量較小,極易通過血腦屏障發(fā)揮作用。Ala經(jīng)Ia類傳入纖維興奮,激活抑制性中間神經(jīng)元而釋放至突觸間隙,與突觸后膜特異性受體結(jié)合,開啟Cl-通道引起突觸后膜超級化。然而哺乳動物不同腦區(qū)切片顯示,脊髓、延髓和腦橋等存在著親和力攝取系統(tǒng),只是親和力不如Gly那樣高[14]。目前,對Ala和學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系尚未見報(bào)道。眾所周知,GABA對中樞神經(jīng)元有普遍性的抑制作用。中樞谷氨酸/γ-氨基丁酸(glutamic acid,Glu/GABA)是參與學(xué)習(xí)、記憶的關(guān)鍵和必須的氨基酸,并且兩者起著相反的作用,對學(xué)習(xí)、記憶起正性調(diào)節(jié)作用氨基酸為Glu,反之為GABA,二者之間的對立統(tǒng)一關(guān)系,兩者都不可忽視。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VD模型大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)Ala和GABA均明顯增加,提示它們可能作為抑制性遞質(zhì)參與VD的記憶認(rèn)知障礙過程中。

    雖然本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示海馬DG區(qū)的Gln、Tau、Ala和GABA可能與VD的記憶認(rèn)知障礙有關(guān)系,但其具體的作用機(jī)制和相互關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

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