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    四珍力維膠囊抑菌活性與微生物限度檢查方法研究

    2012-10-16 01:15:32嘉,張儒,賈
    實用藥物與臨床 2012年10期
    關(guān)鍵詞:埃希菌瓊脂大腸

    費 嘉,張 儒,賈 陽

    四珍力維膠囊是根據(jù)首長保障需要,由北京軍區(qū)總醫(yī)院制劑中心研制而成。本制劑主要由冬蟲夏草、西紅花、紅景天、西洋參等珍貴中藥材及有效部位群組成。經(jīng)實驗研究表明,本品具有活血化瘀、降低血液粘稠度、改善心腦血液循環(huán)、提高耐缺氧能力、補益心腦、滋陰壯陽、扶正固本、緩解人體疲勞、增強免疫力、雙向調(diào)節(jié)作用的功能,而且經(jīng)臨床實驗證實,本制劑能保護心肌及腦組織、抗冠心病、擴張血管、降低血壓,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用。此外,還有抗炎增智、降脂保肝、滋補強壯、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用。本文按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法的要求,對其微生物限度檢查方法進行探討。

    1 儀器和試藥

    1.1 儀器 電熱恒溫干燥箱(上海滬南科學(xué)儀器廠),LRH-250A生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠),LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),XG1-DI型手控小型滅菌器(山東新華醫(yī)療機械廠),UV-1三用紫外燈(上海顧村電光儀器廠),AEL-200天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司),WHCD-凈化工作臺(北京五環(huán)空調(diào)凈化工程公司),JLQ-S1菌落計數(shù)器(無錫縣金城儀器廠)。

    1.2 試藥 四珍力維膠囊(規(guī)格:每粒裝0.4 g,批號:060909,北京軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑中心提供)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus.)[CMCC(B)26003],大腸埃希菌(Escherichia Coli.)[CMCC(B)44102],枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis.)[CMCC(B)63501],白色念珠菌(Candida albicans.)[CMCC(F)98001],黑曲霉(Aspergillus niger.)[CMCC(F)98003],沙門菌(Salmonella.)(北京軍區(qū)藥檢所提供)。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號:050121),改良馬丁培養(yǎng)基(批號:06121),營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號:050328),玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號:060216),曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基(批號:0503282),膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號:050224),MUG培養(yǎng)基(批號:050911),改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號:070520),四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(批號:060510),膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(批號:060303),pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:050719)均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 菌液制備 分別取經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL加9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液,10倍稀釋至 10-5~10-7,菌數(shù)約為 50~100 cfu/mL;取經(jīng)25℃培養(yǎng)24~48 h的白色念珠菌霉菌改良馬丁培養(yǎng)物1 mL加9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液,10倍稀釋至10-5,菌數(shù)約為50~100 cfu/mL;取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物,加3~5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,吸取出菌液,用標準比濁管比濁,取比濁后的菌液1 mL加9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液,10倍稀釋至 10-4,菌數(shù)約為 50~100 cfu/mL,做計數(shù)備用。

    2.2 供試液制備 因供試品為貴重藥品,檢驗量由10 g酌減為3 g。取樣品3 g,加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至90 mL,振搖使分散均勻,制成1∶30供試液,做計數(shù)備用。另取樣品1 g,加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10 mL,振搖使分散均勻,制成1∶10供試液,做控制菌檢查備用。

    2.3 計數(shù)方法驗證

    2.3.1 試驗組 根據(jù)四珍力維膠囊的組方特點以及理化性質(zhì),我們采用了常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進行計數(shù)方法的驗證。取1∶30供試液1.0、0.5和0.2 mL,加入平皿,隨后分別加入 50~100 cfu/mL的試驗菌,立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72 h觀察結(jié)果。

    2.3.2 菌液組 取50~100 cfu/mL的試驗菌1 mL加入平皿中,立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72 h觀察結(jié)果,測定每一菌株的試驗菌數(shù)。

    2.3.3 供試品對照組 取1∶30供試液1.0、0.5和0.2 mL,加入平皿中,立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72 h觀察結(jié)果,測定供試品本底菌數(shù)。

    2.3.4 稀釋劑對照組 取pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL和50~100 cfu/mL的試驗菌加入平皿中,立即傾注不超過45℃的瓊脂培養(yǎng)基20 mL,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72 h觀察結(jié)果。2.3.5 計數(shù)方法驗證結(jié)果 見表1。

    表1 四珍力維膠囊微生物限度計數(shù)方法的驗證結(jié)果

    從表1結(jié)果可見,四珍力維膠囊細菌計數(shù)方法的驗證采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿),可消除供試品對人工污染枯草芽孢桿菌的抑制作用,回收率均高于70%。

    2.4 控制菌檢查方法的驗證 本品為口服制劑,并且組方中含有動物藥以及藥材原粉,按照《中國藥典》一部的要求,需要對大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌進行檢查。

    2.4.1 大腸埃希菌 (1)試驗組:取1∶10供試液10 mL、10~100 cfu/mL的大腸埃希菌1 mL分別加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)18~24 h。依照大腸埃希菌的檢查方法檢查。(2)陰性菌對照組:采用金黃色葡萄球菌為陰性對照菌,檢查方法同試驗組。(3)陽性對照組:取10~100 cfu/mL的大腸埃希菌1 mL加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基,依法培養(yǎng),檢查方法同試驗組。(4)陰性對照組:取pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液30 mL直接接種于100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,檢查方法同試驗組。

    2.4.2 大腸菌群 (1)試驗組:取含10 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1管,加入1∶10的供試液1 mL(含供試品0.1 g),再加入10~100 cfu大腸埃希菌,混勻,35℃培養(yǎng)18~24 h后觀察結(jié)果。(2)陰性菌對照組:采用金黃色葡萄球菌為陰性對照菌,檢查方法同試驗組。(3)陽性對照組:取含10 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1管,加入10~100 cfu大腸埃希菌,混勻,檢查方法同試驗組。(4)陰性對照組:取含10 mL的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基1管,加入稀釋液作為陰性對照管,混勻,35℃培養(yǎng)18~24 h后觀察結(jié)果。

    2.4.3 沙門菌 (1)試驗組:取供試品10 g以及50~100 cfu/mL的沙門菌1 mL直接接種于200 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,攪拌混勻,35℃培養(yǎng)18~24 h后接種于10 mL四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中,35℃培養(yǎng)18~24 h后,分別平板劃線,35℃培養(yǎng)18~24 h。依照沙門菌的檢查方法檢查。(2)陰性菌對照組:采用金黃色葡萄球菌為陰性對照菌,檢查方法同試驗組。(3)陽性對照組:取50~100 cfu/mL的沙門菌1 mL加入到200 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,攪拌混勻,檢查方法同試驗組。(4)陰性對照組:取200 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,檢查方法同試驗組。

    2.4.4 控制菌檢查方法驗證的結(jié)果 見表2。從表2的結(jié)果可以看出:四珍力維膠囊控制菌項下的大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌的檢查法采用常規(guī)方法可正常檢出。

    表2 四珍力維膠囊控制菌檢查方法的驗證結(jié)果(常規(guī)法)

    2.5 微生物限度檢查方法的建立 根據(jù)上述驗證結(jié)果,四珍力維膠囊細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 mL/皿),以枯草芽孢桿菌為陽性對照菌進行檢驗,霉菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)法檢驗;控制菌檢查項下的大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌的檢查可采用常規(guī)方法,依法檢驗。

    3 討論

    該制劑對枯草芽孢桿菌有較強的抑菌作用,提示該制劑對芽孢桿菌有較強的抑制作用,但是對真菌和革蘭陽性菌沒有抑制作用。本制劑可采用培養(yǎng)基稀釋法消除其抑菌作用,本方法用于微生物限度的檢查準確、有效。

    [1]藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:附錄79-88.

    [2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:325-373.

    [3]許華玉,杜蕓,錢文靜,等.藥品微生物限度檢查法中細菌和真菌計數(shù)方法的驗證試驗[J].中國中藥雜志,2005,30(24):1918-1920.

    [4]周修森,李道明.甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,7(4):42-44.

    [5]趙建英,壽文虹,李愛玲.加強藥品無菌檢查和微生物限度檢查方法驗證的對策[J].中國藥業(yè),2008,17(8):6-7.

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