胃痛消痞方對(duì)肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠血清及胃竇組織中NT、SP含量的影響

吳艷慧，于文靖，陳蘇寧

功能性消化不良(FD)是一組無胃腸道器質(zhì)性病變，以持續(xù)性腹痛、腹脹、早飽、惡心嘔吐、噯氣、反酸、燒心、食道異物感等為表現(xiàn)的臨床癥候群，其發(fā)生與胃腸動(dòng)力障礙密切相關(guān)。胃腸激素是影響胃腸動(dòng)力的重要因素，神經(jīng)降壓素(Neurotensin)對(duì)其具有抑制作用，P物質(zhì)(P-substance)是胃腸運(yùn)動(dòng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)將FD歸屬于“胃脘痛”和“痞滿”等范疇，其主要病機(jī)是肝郁氣滯、脾胃虛寒。本實(shí)驗(yàn)通過觀察胃痛消痞方對(duì)肝郁脾虛型FD大鼠血清及胃竇中NT、SP含量的影響，探討肝郁脾虛型FD的發(fā)病機(jī)制，旨在指導(dǎo)其臨床治療。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康SPF級(jí)Wistar雄性大鼠40只，12周齡，體質(zhì)量為250～280 g。

1.2 藥物 胃痛消痞方由柴胡、白芍、延胡索、枳實(shí)、砂仁、炒麥芽、焦山楂、炒雞內(nèi)金、黨參、炒白術(shù)、炙甘草組成，由深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥集團(tuán)提供免煎顆粒，用蒸餾水稀釋成濃度為0.5 g/mL的溶液，4℃冰箱保存;西沙必利片為上海滬源醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品，給藥前用蒸餾水稀釋成0.02 g/mL的溶液。

1.3 試劑 NT、SP酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒由美國(guó)RD公司提供;NT、SP抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，SP免疫組化染色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 儀器 ELx808吸收光酶標(biāo)儀、D-37520 Heraeus高速冷凍離心機(jī)、DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱、TB-718D生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、Mettler-Tole-DO AL104型電子天平、TK-218型恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)、ZT-12M 生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、Microm HM340E半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、NIKON E800光學(xué)顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及給藥 將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表方法隨機(jī)分為4組，即胃痛消痞方(中藥)組、西沙必利(西藥)組、模型組、正常對(duì)照組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余3組均采用改良夾尾刺激法［1］制造FD肝郁脾虛模型，每次夾尾刺激持續(xù)30 min，2次/d，連續(xù)刺激21d。造模成功后，將胃痛消痞方、西沙必利依據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式［2］dB=dARB/RA(WA/WB)1/3 進(jìn)行計(jì)算，中藥組給予胃痛消痞方9 g/kg，1次/d，西藥組給予西沙必利2 mg/kg，模型組及正常對(duì)照組給予灌服等量蒸餾水，1次/d灌胃，持續(xù)21d。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 ELISA法檢測(cè)血清中NT含量 分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔，記錄各孔位置。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，待測(cè)樣品孔加入各組血清40 μL，然后各加入抗-NT 抗體10 μL、鏈霉素親和素-HRP50 μL，空白對(duì)照孔不加，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37℃溫育60 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次。每孔先加入顯色劑A液50 μL，再加入顯色劑B液50 μL，用手輕輕震蕩混勻30 s，37℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的OD值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

2.2.2 按“2.2.1”項(xiàng)方法檢測(cè)血清中SP含量。

2.2.3 免疫組化法測(cè)定胃竇組織中NT、SP含量標(biāo)本固定后進(jìn)行梯度脫水，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，常規(guī)脫蠟至水。用3%H2O2室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS洗3次。將切片浸入0.01 mol檸檬酸鈉緩沖液(pH值6.0)，電爐加熱至沸騰后斷電，5 min后取出置室溫冷卻。冷卻后PBS洗滌3次，3 min/次。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩出多余液體。滴加適當(dāng)稀釋的一抗(分別為兔抗大鼠NT抗體和兔抗大鼠SP抗體)，4℃ 冰箱過夜。取出后PBS洗3次，3 min/次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫孵育20 min，PBS洗3次，3 min/次。滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20 min，PBS洗3次，3 min/次。取1 mL蒸餾水，加DAB顯色試劑盒A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間30 s。蘇木素輕度復(fù)染1 min，脫水，透明，封片，晾干，用光學(xué)顯微鏡(10×40倍)觀察胃腸組織中NT、SP陽性產(chǎn)物的分布。用HUMIAS-2000醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，通過顯微攝像系統(tǒng)放大400倍，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)無重疊視野，測(cè)定胃竇及十二指腸組織中NT、SP陽性纖維的平均灰度值，以此分別代表NT、SP的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 模型組血清、胃組織中NT含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明造模成功。經(jīng)治療后，中藥組、西藥組NT含量均明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥組和西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠血清、胃組織中NT含量(mg/L)

3.2 模型組血清、胃組織中SP含量明顯降低，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明造模成功。經(jīng)治療后，中藥組、西藥組SP含量明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中藥組和西藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 大鼠血清、胃組織中SP含量(mg/L)

3.3 每張切片于400倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別觀察其陽性產(chǎn)物的分布、染色情況，光鏡下，大鼠胃組織中NT、SP染色部位在胞漿，胞大而核圓，棕色或深黃色為強(qiáng)陽性，黃色為陽性，淡黃色為弱陽性。見圖1。

圖1 四組光鏡下NT、SP的分布及染色情況

4 討論

胃痛消痞方由柴胡、白芍、延胡索、炒枳實(shí)、砂仁、炒麥芽、焦山楂、炒雞內(nèi)金、黨參、炒白術(shù)、炙甘草組成。柴胡可疏肝行氣解郁，配伍陳皮理氣降逆，共為君藥;厚樸、炒枳實(shí)、山楂、神曲、炒麥芽、炒白術(shù)、砂仁可燥濕除滿、理氣和中、消食，共為臣藥;白芍功善養(yǎng)血柔肝、補(bǔ)陰抑陽，為佐藥;甘草調(diào)和全方。諸藥共奏疏肝理氣、和胃健脾之功，使肝疏泄條達(dá)、脾升胃降得復(fù)，紊亂的消化功能得以恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用夾尾法使大鼠激怒，進(jìn)而肝氣不舒，肝郁犯脾，脾失健運(yùn)，從而建立了肝郁脾虛型FD大鼠模型，治法當(dāng)以疏肝健脾為主。

1975年Carraway等確定NT為13個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，由開放型的N細(xì)胞分泌，而約85%的N細(xì)胞存在于胃腸道。既往已有較多研究表明，NT 可抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)，延緩胃排空［3-5］。Nightingale等［6］發(fā)現(xiàn)，回腸切除術(shù)后的患者，由于N細(xì)胞減少，血漿NT水平降低，從而導(dǎo)致液體在胃中排空加速。SP主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道神經(jīng)系統(tǒng)，小部分分布于腸嗜鉻細(xì)胞，是腸道感覺神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與痛覺傳導(dǎo)有關(guān)，可能參與各種內(nèi)臟神經(jīng)反射，能促進(jìn)腸道平滑肌收縮和腸蠕動(dòng)，促進(jìn)胃排空［7-8］，并且能刺激膽囊收縮。也有研究證明，SP是胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于腸肌神經(jīng)叢內(nèi)的SP神經(jīng)細(xì)胞體發(fā)出神經(jīng)纖維到腸壁各層，可能參與各種內(nèi)臟神經(jīng)反射，并通過特異的神經(jīng)通路來促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮和腸蠕動(dòng)，調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力和排空功能［9］。

本研究結(jié)果顯示，模型組血清NT含量與正常對(duì)照組相比明顯升高，SP含量降低，模型組大鼠較正常組相比胃竇及十二指腸部NT陽性免疫產(chǎn)物增多，SP陽性免疫產(chǎn)物明顯減少，說明NT升高、SP降低均可能是引起FD的原因。治療后，中藥組、西藥組NT含量均明顯降低，SP含量明顯升高，亦證實(shí)了上述觀點(diǎn)，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了神經(jīng)降壓素及P物質(zhì)是FD發(fā)病的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中藥胃痛消痞方的臨床應(yīng)用及今后進(jìn)一步研究提供了重要依據(jù)。

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