樺褐孔菌多糖的提取工藝優(yōu)化及其對小鼠免疫功能的影響

李 宏

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，赤峰 內(nèi)蒙古 024001）

樺褐孔菌多糖的提取工藝優(yōu)化及其對小鼠免疫功能的影響

李 宏

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，赤峰 內(nèi)蒙古 024001）

本文通過響應(yīng)面分析對樺褐孔菌多糖的提取工藝進行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝為提取溫度100℃，提取時間3.5h，料液比1:25(g/mL).在最佳提取工藝條件下，樺褐孔菌提取物多糖得率達到1.97%.樺褐孔菌粗多糖對正常小鼠和環(huán)磷酰胺致低免疫力小鼠碳粒廓清、淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗表明：樺褐孔菌粗多糖可顯著提高正常和低免小鼠碳粒廓清功能和淋巴細胞增殖水平.

樺褐孔菌；多糖；提取；響應(yīng)面；免疫功能

樺褐孔菌（Inonotus obliquus)主要分布于俄羅斯北部、北歐、中國黑龍江、吉林長白山、日本北海道等北緯40～50度地區(qū).民間廣泛用于防治消化道疾病和腫瘤(胃癌、腸癌及肝癌等)、心血管疾病、糖尿病和抗病毒等[1，2].大量研究表明，樺褐孔菌中含有三萜類[3]、多酚類[4]、黑色素[5]和多糖[6]等活性物質(zhì)，具有很高的免疫活性[4-6].本文通過響應(yīng)面分析對樺褐孔菌多糖的提取工藝進行了優(yōu)化，并對提取物的免疫活性進行了初步評價.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide,CY）上海華聯(lián)制藥有限公司；綿羊血,RPMI-1640不完全培養(yǎng)液,刀豆蛋白（ConA）,MTT（四甲基偶氮唑鹽）天津鼎國；DMSO（二甲基亞砜）美國Sigma公司；印度墨汁 北京西中化工；黃芪顆粒（國藥準字號）四川百里藥業(yè).

樺褐孔菌由吉林延邊自治州延吉食用菌研究所提供，粉碎、備用.

兩周齡Balb/c小鼠，雄性，體重18-22g，室溫（20-22℃），自由攝食、飲水.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供.

1.2 儀器設(shè)備

Uvmini-1240紫外可見分光光度計（日本島津），SORVALL pico臺式高速離心機；MK3型酶標儀（美國Thermo公司），CO2培養(yǎng)箱（美國 Thermo公司），生物顯微鏡（TE2000-U日本愛尼），超凈臺（SW-CJ-IFD 蘇州凈化）.

1.3 實驗方法

1.3 試驗方法

1.3.1 樺褐孔菌粗多糖提取工藝優(yōu)化

準確稱取10.00g樺褐孔菌，加入一定量的水回流提取2次，合并提取液、減壓濃縮、醇沉、除蛋白、冷凍干燥，得到粗提物干粉于4℃冰箱中備用.

實驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示，以多糖得率為評價指標，重復(fù)3次.多糖含量采用硫酸-苯酚法測定.

1.3.2 樺褐孔菌粗多糖對小鼠碳粒廓清吞噬能力的影響

BALb/c小鼠80只，隨機分為8組，每組10只（正常小鼠4組；低免小鼠4組,其中免疫力低下小鼠于實驗前兩天皮下注射環(huán)磷酰胺50mg/kg體重，每天一次，共兩次，以造成免疫低下模型），按低、中、高計量連續(xù)灌喂14d，于試驗的第15d，尾靜脈注射稀釋五倍的印度墨汁0.1ml/10g，分別于1min和10min眼底靜脈叢取血，600nm下測OD值，計算吞噬指數(shù)K[7].空白對照組每天灌胃等量生理鹽水，陽性對照組每天灌胃黃芪顆粒配成的溶液（50mg/Kg），0.1mL/10g體重.

1.3.3 樺褐孔菌粗多糖對小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

采用體外培養(yǎng)法[8]:實驗分組及操作同1.3.2，于試驗的第15d脫頸處死，無菌取出脾臟.用5mL注射器吸取3～5 mL的RPMI-1640不完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，將脾細胞懸液收集到無菌離心管中，1500r/min，離心5min，棄上清液，再加入10mL紅細胞裂解液 (pH為7.4的Tris-NH4CI),沉淀用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液配制成2×106個/mL的脾細胞懸液.于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入脾細胞懸液100μL、20μL終濃度為 50μg/mL的 ConA溶液和 80μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，空白加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液200μL，每組設(shè)六個重復(fù).培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h.終止培養(yǎng)前4h，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng).培養(yǎng)結(jié)束，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，然后每孔加入150μLDMSO，稍振蕩使紫色結(jié)晶完全溶解，以空白對照調(diào)零，酶標儀測定570nm處的吸光度值(OD).

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SAS9.0和SPSS軟件處理后用X±S表示，組間差異采用t檢驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面分析優(yōu)化

利用SAS9.0軟件，以多糖得率為評價指標，通過響應(yīng)面對溫度、時間和料液比三因素進行分析，具體實驗設(shè)計及結(jié)果如表1所示，回歸方程如下：

多糖得率的響應(yīng)面實驗方差分析見表2.在多糖提取過程中，溫度（X1）、時間（X2）、對多糖得率的影響非常顯著（P<0.01），料液比（X3）、溫度的二次項（X12）對多糖提取率的影響較顯著（P<0.05）.

表1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 多糖得率的響應(yīng)面實驗因素方差分析

根據(jù)回歸方程，溫度（X1）、時間（X2）、料液比（X3）對得率的響應(yīng)面分析圖如圖1、圖2、圖3、所示.通過分析可知溫度（X1）的升高和時間（X2）的延長有利于多糖成分的溶出.通過回歸分析可得到最優(yōu)提取條件為：溫度100℃、時間3.5h、料液比25：1（mL/g），模型預(yù)測多糖得率為1.962%，在此條件下進行驗證實驗，得率達到1.97%.

圖1 溫度和時間對多糖得率的優(yōu)化曲線圖（料液比固定為 20：1（mL/g））

圖2 溫度和料液比的優(yōu)化曲線圖（時間固定為3h）

圖3 時間和料液比的優(yōu)化曲線圖（溫度固定為95℃）

2.2 樺褐孔菌粗多糖對正常和低免模型小鼠碳粒廓清吞噬指數(shù)的影響

表3 樺褐孔菌多糖對正常和低免模型小鼠碳粒廓清吞噬指數(shù)的影響

非特異性免疫是特異性免疫的基礎(chǔ)，特異性免疫所產(chǎn)生的免疫物質(zhì)又能增強非特異性免疫的作用，因此，增強機體的非特異性免疫對提高機體的整個免疫功能意義重大.單核巨噬細胞是非特異性免疫的重要組成細胞之一.當(dāng)細菌、異物等抗原性物質(zhì)進入機體后，可迅速被機體單核巨噬系統(tǒng)吞噬和清除，因而巨噬細胞廓清指數(shù)可以反映其吞噬功能的強弱.樺褐孔菌多糖對正常及免疫力低下模型小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響結(jié)果見表3.

由表3可知，樺褐孔菌粗多糖對正常小鼠低、中、高劑量組的校正吞噬指數(shù)均顯著增加（p<0.01），對低免小鼠低、中、高劑量組的校正吞噬指數(shù)均極顯著增加（p<0.001），且等劑量的樺褐孔菌多糖與陽性對照黃芪多糖的吞噬指數(shù)接近，說明樺褐孔菌多糖可使正常和低免小鼠的單核巨噬細胞系統(tǒng)吞噬異物的能力顯著提高，從而增強小鼠的非特異性免疫功能.

2.3 樺褐孔菌粗多糖對正常小鼠和低免小鼠體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

淋巴細胞在受到抗原或有絲分裂原的刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的最初階段，是使靜止的淋巴細胞活化增殖成為有活性的細胞.本實驗利用刀豆蛋白（ConA）刺激T淋巴細胞，經(jīng)刺激后增殖的T淋巴細胞采用MTT法進行檢測.

圖4顯示了T細胞受到ConA刺激后，細胞體積增大，代謝旺盛（呈團簇狀增長）的增殖情況及加入MTT后，細胞活化增殖時通過線粒體能量代謝過程將MTT代謝形成藍紫色結(jié)晶后，在細胞內(nèi)或細胞周圍形成了較清晰藍紫色的情況.

圖4 細胞的轉(zhuǎn)化增殖情況（a正常細胞，b加入ConA后，c加入MTT后）

由表4可知，樺褐孔菌粗多糖低、中、高劑量組對正常小鼠淋巴細胞均有顯著的增殖作用（低劑量糖p<0.01，中、高劑量糖p<0.001），高于空白組，對免疫力低下模型小鼠的淋巴細胞均有極顯著的增殖作用（p<0.001），接近于陽性對照藥物（國藥準字號黃芪顆粒）對淋巴細胞的增殖作用.說明樺褐孔菌粗多糖可以顯著促進正常和環(huán)磷酰胺致低免小鼠機體的T淋巴細胞增殖，從而增強機體的免疫力.

3 結(jié)論

本文通過響應(yīng)面分析對樺褐孔菌多糖的微波輔助提取工藝進行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝為提取溫度100℃，提取時間3.5h，料液比1:25(g/mL).在最佳提取工藝條件下，樺褐孔菌提取物多糖得率達到1.97%.

樺褐孔菌粗多糖對正常小鼠和環(huán)磷酰胺致低免疫力小鼠碳粒廓清、淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗表明：樺褐孔菌粗多糖可顯著提高正常和低免小鼠碳粒廓清功能和淋巴細胞增殖水平.

表4 樺褐孔菌粗多糖對正常和低免小鼠體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響

〔1〕MaretS (1991)Fungiin Khanty folk medicine.J Ethnopharmacol31:175-179.

〔2〕Mizuno T,Zhuang C,Abe K,et al.Antitumor and hypoglycemic activities of polysaccharides from the sclerotia and mycelia of Inonotus obliquus (Pers.:Fr.)pil.(A-phyllophoromycetideae)[J].Int J Med Mushrooms.1999,1:301-316.

〔3〕Yusoo Shin,Yutaka Tamai,Minoru Terazawa.Chemical constituents of Inonotus obliquus，a new triterpene,21,24-cyclopentalanosta-3β,21,25-triol-8-enefrom sclerotium[J].The Japan Wood Research Society(2001)47:313-316.

〔4〕yong Cui,Dong-Seok Kim,Kyoung-Chan Park.Antioxidant effect of Inonotus obliquus[J].Journal of Ethnopharmacology2005,96:79-85.

〔5〕Yong Ook Kim,Hae Woong Park,Jong Hoon Kim,et al.Anti-cancer effect and sructural characterization of endo-polysacchridefrom cultivated myceliaofInonotus obliquus[J].Life science79(2006)72-80.

〔6〕Song HS,Lee YJ,Kim SK,et al.Downregulatory effect of AGI-1120(α-glucosidase inhibitor)and Chaga mushoom(Inonotus obliquus)on clluar nfκb activation and their antioxidantactivity.[J].Korean Jpharmacogen 2004,35:92-97.

〔7〕鄧靜修,劉芳,陳如泉.地甘口服液促進T淋巴細胞轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定淋巴細胞的實驗研究 [J].中華實用中西醫(yī)雜志,2002，2(15):586～587.

〔8〕徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

R285.5

A

1673-260X（2012）02-0128-03