轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉與轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉荒地的生存競爭能力

張興華，田紹仁，張?zhí)煊瘢?捷，喬艷艷

江西省棉花研究所，江西九江332105

蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis δ-內(nèi)毒素晶體蛋白基因簡稱 Bt基因(Crickmore et al.，1998)，是世界上應(yīng)用最廣泛的生物殺蟲劑(關(guān)雄，2006)。據(jù)統(tǒng)計，已報道的 Bt基因有60種以上。根據(jù)它們的殺蟲范圍和基因序列差異，可大致分為6 類，即 cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cryt。每一類中又包含不同的亞類，前5類稱為晶體蛋白基因家族，第6類稱為細胞外溶性晶體蛋白基因(張洪瑞等，2008)。1981年Shnepf＆Witeleg首次從蘇云金芽孢桿菌中分離并克隆了Bt基因，美國孟山都公司將Bt基因經(jīng)過啟動子改造后轉(zhuǎn)入棉花中，于1995年獲得了2種轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉NUCOTN33B和NUCOTN35B(謝德意，2001)。我國于1990年從蘇云金芽孢桿菌亞種aizawai7-29和KurstakiHD-1中分離克隆了Bt基因(謝道昕和范云六，1991);后對其進行改造并獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲性極強的 Bt基因［GFM cry1A BT基因(cry1Ab、cry1Ac)］(郭三堆，1993;郭三堆等，1993)，且由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物工程中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所等單位將改造的Bt基因轉(zhuǎn)入國產(chǎn)棉花品種中，于1994年成功獲得了第一批國產(chǎn)轉(zhuǎn)單價Bt基因抗蟲棉(張銳等，2007)。1998年孟山都公司將腈水解酶基因BXN與Bt基因同時轉(zhuǎn)入一個棉花中，獲得既抗蟲又抗溴苯腈除草劑的棉花品種(馮堅，2006)。

近幾年，我國又推出了轉(zhuǎn)雙價Bt和豇豆胰蛋白酶抑制抗蟲基因(cry1Ac+CPTI)棉(Wu＆Guo，2005)、轉(zhuǎn)雙價雙Bt抗蟲基因(cry1Ac+cry2Ab)棉(雒珺瑜等，2011)、轉(zhuǎn)雙價抗蟲和抗除草劑基因(cry1Ac+EPSPS)棉、轉(zhuǎn)雙價抗病基因(Chi+Glu)棉等新品種。對于這些新的轉(zhuǎn)基因棉花品種，必須在推廣種植前進行環(huán)境安全風(fēng)險評估。我國僅在2007年公布了1項技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，即農(nóng)業(yè)部953號公告-12-2007(以下簡稱953號公告)。但該標(biāo)準(zhǔn)僅適用于轉(zhuǎn)單價Bt基因抗蟲棉，一些新的轉(zhuǎn)雙價復(fù)合基因棉仍缺乏環(huán)境安全評價技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。為此，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部從“十一五”起開始設(shè)立環(huán)境安全評價技術(shù)研究專項。本文對轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉與轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉荒地的生存競爭能力進行研究，以期為轉(zhuǎn)雙價雙Bt抗蟲基因棉和轉(zhuǎn)雙價抗蟲、抗除草劑基因棉環(huán)境安全評價技術(shù)的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗品種:轉(zhuǎn)雙價雙Bt抗蟲基因(cry1Ac+cry2Ab)棉，轉(zhuǎn)雙價抗蟲、抗除草劑基因(cry1Ac+EPSPS)棉均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供;對照品種:非轉(zhuǎn)基因常規(guī)棉——贛棉11號為江西省棉花研究所研制品種。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗地設(shè)在江西省棉花研究所內(nèi)，面積40 m×6 m。試驗品種和對照品種各設(shè)4個重復(fù)，隨機排列，每個重復(fù)的小區(qū)面積為3 m×2 m，播40粒棉種，分地表撒播和3 cm深度點播2種方式。播種后不進行任何栽培管理。

1.2.2 調(diào)查內(nèi)容 試驗期間調(diào)查優(yōu)勢雜草種類、高度和覆蓋度(目測各種雜草占小區(qū)的比例)，棉花出苗數(shù)、株高、生育進程(蕾、鈴、吐絮)、吐絮瓣數(shù)、吐絮瓣脫落率、自生苗等指標(biāo)。

1.2.3 調(diào)查時間 于2011年5月4日播種前調(diào)查各小區(qū)雜草種類、高度和覆蓋度，6月5日播種后30 d開始第1次調(diào)查，以后每隔1個月調(diào)查1次，至11月上旬結(jié)束。2012年3月底進行第2次吐絮棉瓣脫落率和自生苗調(diào)查。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將試驗數(shù)據(jù)進行方差分析、LSD最小顯著性極差檢驗。其中，由于吐絮瓣數(shù)和絮瓣脫落率各有1～2個小區(qū)數(shù)據(jù)為0，無法進行生物統(tǒng)計上的差異顯著性分析。鑒于此，作者應(yīng)用普通方法進行統(tǒng)計，自定差異顯著性標(biāo)準(zhǔn):＜5%為差異不顯著，5% ～10%為差異顯著，＞10%為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 地表撒播競爭能力表現(xiàn)

2.1.1 播種前雜草情況 播種前，試驗地雜草平均覆蓋度95.4%，平均高度10～70 cm。其中，優(yōu)勢雜草5種:野麥Avena fatua L.、南苜蓿Medicago hispida Gaertn.、野芹菜 Sanicula lamelligera Hance、風(fēng)花菜Rorippaislandica(Oed.)Borb.、豬殃殃 Galium aparine L.var.tenerum(Gren.Et Godr.)Rcbb.;非優(yōu)勢雜草4種:野老鸛草Geranium carolinianum L.、一年蓬 Erigeron annuus(L.)Pers.、刺兒菜 Cephalanoplos segetum(Bge.)Kitam.、小飛蓬 Conyza canadensis(L.)Cronq.;其他雜草數(shù)量稀少(表1)。

表1 播種前雜草種類、高度及覆蓋度Table 1 The species，height and coverage of weed before sowing

2.1.2 出苗競爭力 6月 5日和 7月5日:轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為50.0 和57.5 cm，平均覆蓋度分別為 88.8%和 97.5%(表2)，平均出苗率分別為 2.5% 和 6.9%(表 3);轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為47.5 和50.0 cm，平均覆蓋度分別為87.5%和91.3%(表2)，平均出苗率分別為 2.5% 和 5.0%(表 3)。以上指標(biāo)與對照相比差異均不顯著。這表明轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉在6～7月出苗率競爭優(yōu)勢均較小，棉苗被雜草覆蓋。

8月5日和9月5日:轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為150.0和167.5 cm，平均覆蓋度均為100%(表2)，平均出苗率分別為9.4%和10.6%(表3);轉(zhuǎn) cry1Ac+EPSPS 基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為150和175.0 cm，平均覆蓋度均為100%(表2)，平均出苗率分別為5.6%和7.5%(表3)。以上指標(biāo)中，僅9月5日的轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉平均出苗率與對照相比差異顯著，其余均不顯著。

出苗競爭力方面雜草化風(fēng)險評估:(1)直到9月份，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉出苗率與對照相比才表現(xiàn)出顯著的競爭優(yōu)勢，此時已是棉花生長末期，失去了成熟的機會，不能繁殖傳代，因此不具有雜草化風(fēng)險;(2)轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉出苗率與對照相比始終無顯著的競爭優(yōu)勢，也不具有雜草化風(fēng)險。

表2 2種播種方式下小區(qū)雜草高度及覆蓋度Table 2 The height and coverage of weed in each district by two sowing methods

表3 2種播種方式下轉(zhuǎn)基因棉的出苗率、株高及生育進程Table 3 The seedling emergence，height and growing process of transgenic cotton by two sowing methods

2.1.3 株高競爭力 在7～11月5個調(diào)查日中，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉平均株高分別為15.00、21.33、36.78、36.80 和 36.85 cm，轉(zhuǎn) cry1Ac+EPSPS基因棉平均株高分別為 13.75、19.95、28.05、28.13 和29.38 cm，與對照相比差異均不顯著(表3)。這表明在整個生長期，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉與對照相比，株高競爭優(yōu)勢均較弱;與同期雜草(表2)相比，株高也處于劣勢，出苗稀少，一直處于雜草的覆蓋下，生長上無競爭力。由此可見，這2種轉(zhuǎn)基因棉在株高競爭力方面均無雜草化風(fēng)險。

2.1.4 生育進程競爭力 轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉吐絮比對照快1個月(表3)，顯示出生育進程競爭優(yōu)勢，具有一定的雜草化風(fēng)險;轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉成鈴比對照慢2個月(表3)，在生育進程上無競爭力，且在生長期內(nèi)，成鈴未進入吐絮期由此喪失絮棉種子繁殖的機會，從而在棉生育進程競爭力上不具有雜草化風(fēng)險。

2.1.5 吐絮瓣和絮瓣脫落競爭力 2011年11月5日，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉平均吐絮瓣數(shù)分別為1.5和0個，與對照相比差異均不顯著;絮瓣脫落率與對照均為0。2012年3月28日，2種轉(zhuǎn)基因棉的平均吐絮瓣數(shù)分別為8.0和0個，與對照相比差異也不顯著;絮瓣脫落率與對照均為0(表4)。這表明轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉吐絮瓣競爭優(yōu)勢均不顯著，且吐絮的棉瓣不能脫落，喪失了繁殖機會，因此都不具有雜草化風(fēng)險。

表4 2種播種方式下棉吐絮瓣數(shù)和絮瓣脫落率Table 4 The number of cotton boll opening valve and the floc valve dropping rate of cotton by two sowing methods

2.1.6 自生苗 2012年3月 28日，轉(zhuǎn) cry1Ac+cry2Ab基因棉、轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉和對照各小區(qū)均無自生苗，這是由于三者吐絮棉瓣中的棉籽(種子)均為不成熟的空殼。因此，這2種轉(zhuǎn)基因棉無自生苗上的雜草化風(fēng)險。

2.2 3cm深度播種競爭能力表現(xiàn)

2.2.1 播種前雜草情況 播種前，試驗地雜草平均覆蓋度98.3%，雜草平均高度20～120 cm。其中，優(yōu)勢雜草5種:野麥、南苜蓿、野芹菜、風(fēng)花菜、豬殃殃;非優(yōu)勢雜草4種:野老鸛草、一年蓬、小飛蓬、羊蹄Rumex japonicus Houtt.;其他雜草數(shù)量稀少(表1)。

2.2.2 出苗競爭力 6月 5日和 7月5日:轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為52.5和46.3 cm，與對照相比差異均不顯著;平均覆蓋度分別為61.3%和87.5%，與對照相比差異均顯著(表2);平均出苗率分別為13.8%和18.1%，與對照相比，前者差異不顯著，后者差異顯著(表3)。轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為61.3和41.3 cm，與對照相比，前者差異顯著，后者差異不顯著;平均覆蓋度分別為75.0%和88.8%，與對照相比差異均顯著(表2);平均出苗率分別為10.6%和8.8%，與對照相比差異均不顯著(表3)。這表明2種轉(zhuǎn)基因棉在6～7月出苗競爭力較弱，棉苗被雜草覆蓋。

8月5日和9月5日:轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為110.0和120 cm，與對照相比差異均不顯著;平均覆蓋度均為100%，與對照相等(表2);平均出苗率分別為20.6%和24.4%，與對照相比差異均顯著(表3)。轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉各小區(qū)雜草平均高度分別為87.5和115.0 cm，與對照相比差異均不顯著;平均覆蓋度均為100%，與對照相等(表3);平均出苗率分別為14.4%(與對照差異不顯著)和15.6%(與對照相等)，棉苗被雜草覆蓋。

出苗競爭力方面雜草化風(fēng)險評估:(1)在整個生長期中，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉出苗率競爭優(yōu)勢與對照相比均未達到顯著水平，因此不具有顯著的雜草化風(fēng)險;(2)轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉出苗競爭力與對照相比，在7月份之前處于弱勢，到9月份出苗率與對照相等，所以其在出苗競爭力方面也不具有雜草化風(fēng)險。

2.2.3 株高競爭力 7月5日、8月5日、9月5日和10月5日，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉平均株高分別為 25.00、29.50、33.92 和 33.93 cm，轉(zhuǎn) cry1Ac+EPSPS 基因棉平均株高分別為 21.25、30.25、40.51和40.52 cm，與對照相比差異均不顯著(表3);11月5日，各小區(qū)雜草已處于枯萎狀態(tài)。由此可見，這2種轉(zhuǎn)基因棉株高競爭力與對照相比均無顯著優(yōu)勢，不具有雜草化風(fēng)險。

2.2.4 生育進程競爭力 轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉、轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉在生育進程上與對照均一致(表3)，無競爭優(yōu)勢，這也說明它們無雜草化風(fēng)險。

2.2.5 吐絮瓣和絮瓣脫落競爭力 2011年11月5日，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉平均吐絮瓣數(shù)分別為6.8和11個，與對照相比差異均顯著;絮瓣脫落率和對照均為0。2012年3月28日，2種轉(zhuǎn)基因棉平均吐絮瓣數(shù)分別為16.0和36.0個，與對照相比差異均極顯著;絮瓣脫落率分別為0和8.3%，與對照相比差異均顯著(表4)。這表明轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉與對照相比，吐絮瓣和絮瓣脫落競爭力均呈顯著的負優(yōu)勢，不具有繁殖傳代意義上的雜草化風(fēng)險。

2.2.6 自生苗 2012年3月28日，轉(zhuǎn) cry1Ac+cry2Ab基因棉、轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉和對照各小區(qū)均無自生苗，這是由于三者吐絮棉瓣中的棉籽(種子)均為不成熟的空殼。因此，這2種轉(zhuǎn)基因棉在荒地3 cm深播下無自生苗的雜草化風(fēng)險。

綜上所述，在地表撒播和3 cm深度播種條件下，轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉各項指標(biāo)的競爭能力均無顯著優(yōu)勢，在推廣種植上不存在雜草化風(fēng)險。

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉、轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉和對照非轉(zhuǎn)基因棉在荒地撒播和3 cm深播2種方式的生存競爭能力檢測結(jié)果表明，僅轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉撒播的平均出苗競爭優(yōu)勢與對照相比達到顯著差異，其余檢測指標(biāo)與對照相比均無顯著的競爭優(yōu)勢。因此，從整體上看，可以定性地確定受檢的轉(zhuǎn)cry1Ac+cry2Ab基因棉和轉(zhuǎn)cry1Ac+EPSPS基因棉在推廣種植上不存在雜草化風(fēng)險。

本研究未調(diào)查雜草數(shù)量，而是調(diào)查了雜草覆蓋度。953號公告規(guī)定，在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花生存競爭能力的荒地測定中，需調(diào)查雜草數(shù)量。作者研究發(fā)現(xiàn)，荒地雜草種類繁多，無法調(diào)查雜草株數(shù)，如禾本科和苜蓿類雜草，不僅難以準(zhǔn)確計算，而且極其耗時。另外，其覆蓋度也比一些大型雜草小，如一年蓬、風(fēng)花菜、野芹菜等。由此可見，在植物生長競爭力方面，覆蓋度指標(biāo)更為重要，指標(biāo)越大，說明競爭能力越強，優(yōu)勢也越大。因此作者認為，在荒地競爭能力檢測中，無需調(diào)查雜草數(shù)量，通過調(diào)查、統(tǒng)計各種雜草覆蓋度即可說明其占據(jù)棲息地的競爭能力。

953號公告規(guī)定，在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉荒地生存競爭能力測定中，需對棉花的覆蓋度做調(diào)查。作者研究發(fā)現(xiàn)，棉花在荒地不僅出苗少，植株瘦弱矮小，而且大部分荒地被雜草覆蓋。因此認為，在荒地檢測時對于棉花覆蓋度可以忽略不測，除非有新的轉(zhuǎn)基因棉花在荒地中表現(xiàn)更強的生長競爭力，則可以臨時用游標(biāo)卡尺逐株測量后統(tǒng)計棉花的覆蓋度(張興華等，2010)。

此外，本研究采用百分?jǐn)?shù)方法自定義差異顯著性值。在檢測棉花荒地的生存競爭能力中，由于某個處理中某個重復(fù)小區(qū)會產(chǎn)生無苗生出、無鈴?fù)滦?、無吐絮棉瓣脫落的情況而不能進行生物統(tǒng)計中的方差分析和顯著性檢驗。據(jù)作者研究，在荒地條件下棉長勢不良，出苗株數(shù)稀少，彼此間量值很低，差異值較小。因此，自定義定性評價標(biāo)準(zhǔn):＜5%為差異不顯著，5% ～10%為差異顯著，＞10%為差異極顯著。經(jīng)實踐檢驗，此標(biāo)準(zhǔn)符合實際，且實用性強，可操作性好。在2012年初召開的“轉(zhuǎn)基因抗病棉花生存競爭能力檢測技術(shù)操作規(guī)程和評價指標(biāo)”江西省地方標(biāo)準(zhǔn)審定會上得到評審專家的認可。

馮堅.2006.轉(zhuǎn)基因耐除草劑作物的歷史、現(xiàn)狀及展望.雜草科學(xué)，24(1):1－6.

關(guān)雄.2006.蘇云金芽孢桿菌研究回顧與展望.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，8(6):5－11.

郭三堆.1993.Cry1A殺蟲基因的人工合成.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，26(2):85.

郭三堆，洪朝陽，徐瓊芳，毛立群，范云六.1993.蘇云金芽孢桿菌aizawai7-29δ-內(nèi)毒素基因改造后的殺蟲活性研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，26(5):77－82.

雒珺瑜，崔金杰，張帥，陸雪君.2011.轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉對棉田節(jié)肢動物群落的影響.植物保護，37(6):90－92.

謝道昕，范云六.1991.蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)殺蟲晶體蛋白基因?qū)朊藁ǐ@得轉(zhuǎn)基因植株.中國科學(xué)(B)輯，(4):367－373.

謝德意.2001.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究進展、問題與對策.中國棉花，28(2):6－8.

張洪瑞，朱其松，高苓昌，杜本懷，宋克勤，張士永，陳峰.2008.Bt基因及其在轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中的研究進展.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，12(6):87－89.

張銳，王遠，孟志剛，孫國清，郭三堆.2007.國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究回顧與展望.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，9(4):32－42.

張興華，喬艷艷，李捷.2010.轉(zhuǎn)雙價(Chi+Glu)基因抗病棉栽培地生存競爭能力研究.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，22(6):1－3.

Crickmore N，Zeigler D R，F(xiàn)eitelson J，Schnepf E，van Rie J，Lereclus D，Baum J and Dean D H.1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crustal proteins.Microbiology and Molecular Biology Reviews，62:775 －806.

Wu K M and Guo Y Y.2005.The evolution of cotton pest management practices in China.Annual Review of Entomology，50:31－52.