聚乙二醇修飾重組細(xì)胞珠蛋白對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

李招發(fā)，鄧小英，許佳佳，連文昌

1 華僑大學(xué)分子藥物研究院，福建 泉州 362021

2 華僑大學(xué)分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

生物技術(shù)與方法

聚乙二醇修飾重組細(xì)胞珠蛋白對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

李招發(fā)1,2，鄧小英1,2，許佳佳1,2，連文昌1,2

1 華僑大學(xué)分子藥物研究院，福建 泉州 362021

2 華僑大學(xué)分子藥物教育部工程研究中心，福建 泉州 362021

旨在探究聚乙二醇修飾重組細(xì)胞珠蛋白 (PEG modified recombinant cytoglobin，PEG-rCygb) 對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。采用CCl4誘導(dǎo)KM小鼠急性肝損傷模型，尾靜脈注射PEG-rCygb，收集血清及肝臟組織檢測各項(xiàng)生化指標(biāo)及組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明，PEG-rCygb治療組小鼠肝臟系數(shù)減小, 血清中AST﹑ALT水平降低, 肝組織勻漿中MDA含量減少, GSH含量增加，T-SOD、CAT活性升高。肝組織切片HE染色顯示 PEG-rCygb可以緩解肝細(xì)胞脂肪變性, 減少炎癥因子, 減輕肝細(xì)胞損傷。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明 rCygb經(jīng)PEG修飾后對H2O2造成的肝星狀細(xì)胞 (HSC) 氧化損傷發(fā)揮的保護(hù)作用增強(qiáng)。研究結(jié)果顯示PEG-rCygb提高了機(jī)體對自由基的清除能力, 對CCl4引起的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。

聚乙二醇，重組細(xì)胞珠蛋白，氧化應(yīng)激，急性肝損傷，氧自由基

Abstract:To investigate the protective effect of polyethylene glycol (PEG) modified recombinant cytoglobin(PEG-rCygb) on acute liver damage in mice. The acute liver injury model of KM mice was induced by CCl4and then treated with PEG-rCygb, The liver and blood samples were collected for biochemical and histopathological analysis. The results showed that PEG-rCygb reduced the liver mass index and decreased significantly the levels of alanine amiotransferase (AST) and aspartate transaminase (ALT) in mouse serum. In liver tissues, the content of malondialdehyde(MDA) was decreased, whereas the content of glutathione (GSH) was increased in PEG-rCygb treated group. PEG-rCygb also elevated the activities of total super oxidedismutase (T-SOD) and catalase (CAT) in liver tissues. HE staining of liver tissue slices revealed that PEG-rCygb relieved fatty degeneration of liver, decreased inflammatory factors and reduced liver cell injury. Further in vitro experiments indicated that the protective effects of PEG-rCygb on hepatic stellate cell (HSC)against H2O2were enhanced compared with that of rCygb. All results indicated that the PEG-rCygb promoted oxygen free radical scavenging ability and prevented acute liver injury in KM mice induced by CCl4.

Keywords:PEG, recombinant cytoglobin, anti-oxidative, acute liver damage, oxygen free radical

細(xì)胞珠蛋白 (Cytoglobin，Cygb) 是血紅素球蛋白超家族中的新成員，由Kawada等在大鼠肝星狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[1]，是一個(gè)分子量為 21 kDa的胞漿蛋白。在生理狀態(tài)下以單體形式存在，由190個(gè)氨基酸殘基組成，具有傳統(tǒng)的螺旋轉(zhuǎn)角螺旋三明治結(jié)構(gòu)，在人體各組織及發(fā)育的各個(gè)階段分布廣泛[2]，同其他球蛋白家族成員血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)、肌紅蛋白 (Myoglobin，Mb)和腦紅蛋白 (Neuroglobin，Ngb) 一樣，能夠與氧可逆結(jié)合并具有高親和力[3]。Cygb的抗肝損傷作用主要表現(xiàn)在自由基清除反應(yīng)中的電子傳遞，進(jìn)而抑制自由基誘導(dǎo)的 HSC活化以及隨后的肝組織纖維化。本實(shí)驗(yàn)室曾利用rAAV-2作為載體將cygb基因?qū)隒Cl4和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的雄性SD大鼠肝損傷模型中，在體內(nèi)和體外均發(fā)現(xiàn) Cygb可減少肝組織纖維化[4-5]。此外，本實(shí)驗(yàn)室已成功克隆cygb基因，并建立了成熟的體外表達(dá)純化Cygb蛋白的工藝，在研究中發(fā)現(xiàn)，rCygb對溫度較為敏感、易降解、形成聚體等導(dǎo)致失活[6]。聚乙二醇化 (PEGylation) 是獲得美國FDA批準(zhǔn)的多種藥物制劑的添加物和載體。1977年由Abuchowski等[7]首次將其用來修飾牛血清白蛋白并發(fā)現(xiàn)修飾后的蛋白質(zhì)比未修飾的蛋白更有效。此后，PEG修飾應(yīng)用于蛋白質(zhì)類藥物的研究也逐漸發(fā)展起來。目標(biāo)蛋白經(jīng)修飾后，穩(wěn)定性增加，免疫原性下降，藥物在體內(nèi)的半衰期延長，保證了較高的血藥濃度，從而增加療效[8-9]。本研究利用 (mPEG)2-NHS對rCygb進(jìn)行修飾，通過構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型，細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，探討PEG修飾的rCygb對小鼠急性肝損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

聚乙二醇活性酯 (mPEG)2-NHS購自北京凱正生物工程發(fā)展有限責(zé)任公司；T-SOD、MDA、GSH、CAT、ALT、AST測定試劑盒均購自南京建成生物公司；病理切片石蠟購自上海三精工貿(mào)有限公司；二甲苯、無水乙醇均為AR級，購自汕頭西隴化工有限公司；H.E.染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；rCygb (純度 95%，分子量21 kDa) 為本實(shí)驗(yàn)室制備[6]。肝星狀細(xì)胞株為本研究所保存。

KM小鼠，體重18～20 g，從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司購買 (合格證編號為2007000521085)，動物常規(guī)飼養(yǎng)，室溫 22 ℃～25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 PEG-rCygb制備

在室溫條件下，以 (mPEG)2-NHS活性酯與rCygb的質(zhì)量比9∶1于pH 8.0的Tris-HCl緩沖體系中發(fā)生修飾反應(yīng)，溫和作用 1 h，上樣至SephacrylTMS-100凝膠過濾層析柱，用含0.15 mol/L NaCl和0.01 mol/L的pH 8.0的Tris-HCl平衡液洗脫，收集洗脫峰得到PEG-rCygb純品，用0.22 μm微孔濾膜抽濾后-80 ℃保存。

1.2.2 過氧化物酶活性測定

采用愈創(chuàng)木酚法[6]測定PEG-rCygb和rCygb的過氧化物酶活性，于470 nm處測定光吸收值變化。取 50 mL，10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液 (含0.15 mol/L NaCl)，加入28 μL愈創(chuàng)木酚，磁力攪拌器加熱攪拌至全部溶解后，加入19 μL，30%的H2O2混勻，即可配制反應(yīng)混合液。500 μL反應(yīng)體系，包括 484 μL反應(yīng)混合液和 16 μL rCygb，重復(fù)3次。用緩沖液代替rCygb作為對照。

1.2.3 小鼠急性肝損傷模型構(gòu)建

取雄性KM小鼠64只，隨機(jī)分成8組，每組8只。對照組每天尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL；模型組每天尾靜脈注射生理鹽水0.2 mL；rCygb低、中、高劑量組每天分別尾靜脈注射 rCygb 0.02、0.04、0.08 mg/kg；PEG-rCygb低、中、高劑量組每天分別尾靜脈注射 PEG-rCygb 0.02、0.04、0.08 mg/kg；除對照組外，其他各組預(yù)防治療1周，于第7天腹腔注射0.1% CCl4玉米油造模劑 (10 mL/kg)，禁食不禁水，12 h后先稱重，再摘取眼球取血，3 500 r/m離心10 min獲得血清待測[10-11]。同時(shí)各組均取小鼠肝稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)，并統(tǒng)一取肝左葉塊，部分用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋組織切片，HE染色，顯微鏡觀察肝組織病理變化。部分在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，放入 5 mL小燒杯內(nèi)，充分研碎，制備10%組織勻漿液，用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)2 000 r/min離心10 min，保留上清待測[12]。按照試劑盒說明書操作，測定血清中ALT、AST以及肝組織勻漿液中T-SOD、MDA、CAT、GSH含量。

1.2.4 肝星狀細(xì)胞細(xì)胞毒性檢測

肝星狀細(xì)胞 (HSC) 接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，將經(jīng)0.22 μm微孔濾膜抽濾無菌的rCygb及PEG-rCygb梯度稀釋后，加入到各孔中，rCygb及PEG-rCygb各組終濃度依次為 0.0004、0.002、0.01、0.05、0.25、1.0、5.0、12.5、50 mmol/L，每組設(shè)3個(gè)平行孔，空白組加入等量 D-Hank′s緩沖液作為對照。然后置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度下，分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h和24 h。處理完畢后各孔中加入MTT (終濃度為0.5 g/L)，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，然后吸凈各孔中液體，每孔加入150 μL DMSO，于振板儀緩慢振蕩5 min左右至紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀檢測OD492(630 nm作為對照波長)[13]。

1.2.5 PEG-rCygb抗細(xì)胞氧化應(yīng)激作用檢測

將生長狀態(tài)良好的HSC細(xì)胞接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁良好后，開始實(shí)驗(yàn)處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、模型組 (H2O2)、實(shí)驗(yàn)組 (rCygb和PEG-rCygb預(yù)處理)，每組設(shè)立 3個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)組先用不同濃度的rCygb和PEG-rCygb，各組終濃度依次為：0.05、0.25、1.0、5.0、12.5、25、50、100 mmol/L進(jìn)行預(yù)處理，然后用500 μmolH2O2作用 6 h，模型組只用 H2O2處理。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和增殖情況。MTT法測定細(xì)胞相對增殖率：每孔加入MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，490 nm處檢測A值，計(jì)算細(xì)胞相對增殖率 (Relative growth rate，RGR)[14]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Student'st-test統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 rCygb與PEG-rCygb過氧化物酶活力以及穩(wěn)定性對比

利用愈創(chuàng)木酚法檢測，rCygb過氧化物酶活力為 (253±6.5) U/g，PEG-rCygb的過氧化物酶活力為 (370±30.1) U/g。結(jié)果表明：PEG-rCygb過氧化物酶活力要高于rCygb。在4 ℃保存條件下，rCygb放置1 d后，酶活力略有下降，3 d后酶活力明顯降低，降低約 50%，7 d后酶活力降低84%；而PEG-rCygb酶活力隨著時(shí)間的延長，酶活力降低不明顯，7 d后酶活力降低16% (圖1)。

圖1 rCygb與PEG-rCygb穩(wěn)定性對比Fig.1 The stability of the rCygb contrast PEG-rCygb.

2.2 PEG-rCygb對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響

如表1所示，與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟系數(shù)明顯增加 (P＜0.01)。PEG-rCygb和rCygb各濃度梯度組小鼠肝臟系數(shù)較模型組均有所減低并具有顯著性差異 (P＜0.05)。PEG-rCygb中、低劑量組間肝臟系數(shù)無顯著差異，但PEG-rCygb高劑量組 (0.08 mg/kg) 較rCygb各濃度組更接近對照組 (P＜0.01)。具體數(shù)據(jù)見表 1(肝臟系數(shù)=肝重/體重×100%)。

表1 PEG-rCygb對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響 (n=8,±s)Table 1 Determination of the liver mass index after liver damage by CCl4(n=8,x±s)

表1 PEG-rCygb對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響 (n=8,±s)Table 1 Determination of the liver mass index after liver damage by CCl4(n=8,x±s)

*P<0. 01vscontrol;△P<0.05vsmodel;▲P<0.01vsPEG-rCygb (0.08 mg/kg).

2.3 PEG-rCygb對急性肝損傷小鼠血清及肝組織中相關(guān)指標(biāo)的影響

由表2可以看出，經(jīng) CCl4造模后，模型組小鼠血清中 ALT、AST的活力值顯著增大(P＜0.01)。PEG-rCygb各組小鼠血清中 ALT和AST活力值顯著降低，并且 PEG-rCygb高劑量組 (0.08 mg/kg) 小鼠血清中 ALT活力值較rCygb各劑量組顯著減低 (P＜0.01)，PEG-rCygb中劑量組 (0.04 mg/kg) AST活力值較rCygb各組更接近正常對照組 (P＜0.01)。模型組小鼠血清中CAT活力顯著下降 (P＜0.01)，PEG-rCygb高劑量組 (0.08 mg/kg) 小鼠血清中 CAT活力較rCygb各劑量組小鼠血清中 CAT活力顯著增高(P＜0.01或P＜0.05)。

如表3所示，與正常對照組相比較，模型組小鼠肝組織勻漿中 GSH、T-SOD含量均顯著下降 (P＜0.01或P＜0.05)，且與模型組相比，PEG-rCygb及rCygb各組小鼠肝組織勻漿中GSH、T-SOD含量均明顯上升 (P＜0.01或P＜0.05)。PEG-rCygb高、中、低各劑量組較rCygb相對應(yīng)組更能抑制肝組織中GSH、T-SOD下降 (P＜0.01或P＜0.05)，說明經(jīng)PEG修飾后 rCygb對小鼠急性肝損傷的治療效果更佳。

表2 PEG-rCygb對急性肝損傷小鼠血清AST、ALT、CAT的影響Table 2 Determination of the level of AST, ALT, CAT in serum after treatment (n=8,x±s)

表3 PEG-rCygb對急性肝損傷小鼠組織中SOD、MDA、GSH的影響Table 3 Determination of the level of SOD, MDA, GSH in liver tissue after treatment (n=8,x±s)

與正常對照組相比較，模型組肝組織中MDA 顯著升高 (P＜0.01)，PEG-rCygb各組中MDA的增大程度明顯低于rCygb各組，且具有顯著性差異 (P＜0.05)。

2.4 肝組織病理觀察

2.4.1 肝臟肉眼觀察

CCl4造模后，小鼠解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠肝臟形態(tài)正常，邊緣整齊、表面被膜光滑、色澤紅潤、質(zhì)地柔軟；模型組、PEG-rCygb低劑量組和rCygb低劑量組以及部分rCygb中劑量組小鼠肝組織腫大，有油膩感，色澤暗紅，沙?；潭葒?yán)重，肝緣變鈍，表面有白色物質(zhì)附著，肝葉間有輕微程度的粘連。PEG-rCygb中、高劑量組和rCygb高劑量組白色附著物明顯減少，沙粒程度減輕，質(zhì)地柔軟，但肝組織仍有不同程度的腫大。

2.4.2 HE染色鏡檢

光鏡下可見，空白對照組的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，以中心靜脈為中心呈放射狀排列，未見病理變化；模型組肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不一的空泡，呈脂肪變性，出現(xiàn)多灶性壞死灶，壞死灶內(nèi)細(xì)胞核濃縮、碎裂、溶解，有大量的炎癥細(xì)胞侵潤。rCygb高、中、低劑量組差異較大，rCygb低劑量組細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本清晰，但仍有細(xì)胞腫脹、脂肪變性、炎癥細(xì)胞侵潤等現(xiàn)象。與之相較rCygb中劑量組肝細(xì)胞病變有所改善，但仍有少量炎癥細(xì)胞侵潤。rCygb高劑量組未見炎癥細(xì)胞侵潤，但在中心靜脈周圍有少量空泡結(jié)構(gòu) (圖2)。

PEG-rCygb中、低劑量組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，胞漿內(nèi)仍存在輕微脂肪變性，但與rCygb各組相比病變程度明顯改善，PEG-rCygb高劑量組肝細(xì)胞漿內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)較其他各劑量組明顯減少，與對照組肝細(xì)胞狀態(tài)接近 (圖2)。

圖2 HE染色觀察肝組織病理變化 (100×)Fig.2 The histopathological changes were observed by HE staining in the liver tissues (100×). (A) Control. (B)Model. (C) rCygb (0.02 mg/kg). (D) rCygb (0.04 mg/kg). (E) rCygb (0.08 mg/kg). (F) PEG-rCygb (0.02 mg/kg). (G)PEG-rCygb (0.04 mg/kg). (H) PEG-rCygb (0.08 mg/kg).

2.5 PEG-rCygb對肝星狀細(xì)胞 (HSC) 毒性檢測

如圖 3所示，藥物作用 HSC 12 h后，PEG-rCygb各濃度梯度組同rCygb各濃度梯度組細(xì)胞相對增殖率 (RGR) 無明顯差異，且均接近正常對照組，提示藥物作用HSC 12 h后無HSC細(xì)胞毒性。藥物作用HSC細(xì)胞24 h后，rCygb各低濃度梯度組HSC細(xì)胞相對增殖率略有增高，但不具有顯著性差異，提示 rCygb各濃度組對HSC無細(xì)胞毒性。PEG-rCygb各濃度組細(xì)胞相對增殖率未見顯著上升，同藥物作用HSC 12 h后細(xì)胞相對增殖率無顯著性差異，提示 rCygb經(jīng)PEG修飾后無HSC細(xì)胞毒性，并且增強(qiáng)了其對HSC增殖的抑制作用。

2.6 PEG-rCygb抗 H2O2細(xì)胞氧化應(yīng)激作用檢測

如圖 4所示，模型組 (H2O2) 經(jīng) 500 μmol H2O2作用后，產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，RGR下降(接近50%)。PEG-rCygb各濃度組HSC對H2O2氧化損傷作用有一定的抵抗能力，尤其是較高濃度組 (25、50、100 mmol/L) RGR顯著增高，且較rCygb相應(yīng)濃度組顯著增加，提示經(jīng)PEG修飾后rCygb抗細(xì)胞氧化應(yīng)激作用顯著增強(qiáng)。

圖3 PEG-rCygb對肝星狀細(xì)胞 (HSC) 毒性檢測Fig.3 Detection of cytotoxicity of PEG-rCygb to hepatic stellate cell (HSC).

圖4 PEG-rCygb抗H2O2細(xì)胞氧化應(yīng)激作用檢測Fig.4 Antioxidation effect of PEG-Cygb against H2O2-induced cell damage to hepatic stellate cell (HSC).

3 討論

本研究采用經(jīng)典的 CCl4化學(xué)性損傷動物模型來研究PEG修飾后的rCygb對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。CCl4誘導(dǎo)的肝損傷主要肝毒性機(jī)制為自由基的過快產(chǎn)生及引發(fā)的鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)。CCl4在肝內(nèi)主要被微粒體細(xì)胞色素氧化酶代謝，生成兩個(gè)活性自由基 (CCl3O2·和 C1·) 及一系列氧活性物，誘發(fā)機(jī)體促氧化物與抗氧化物之間的動態(tài)平衡失調(diào)，引發(fā)鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)，并誘導(dǎo)膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體細(xì)胞膜的流動性喪失、通透性增高、造成細(xì)胞損傷[15]。同時(shí)自由基的過快產(chǎn)生使得低分子自由基清除劑 (如GSH) 以及酶性清除劑 (如T-SOD、CAT)大量消耗，造成體內(nèi) H2O2、超氧陰離子自由基(O2-) 增加，最終造成DNA氧化損傷，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞因子凋亡、肝細(xì)胞壞死。

AST是轉(zhuǎn)氨酶中比較重要的一種，主要存在于肝細(xì)胞中的線粒體，當(dāng)肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，線粒體膜破壞，釋放出AST。ALT也是轉(zhuǎn)氨酶中的一種，主要存在于肝細(xì)胞胞漿中，是反映肝細(xì)胞損傷最靈敏的檢驗(yàn)方法，只要1%的肝細(xì)胞受到破壞，其在血清中的含量就可高出一倍。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠腹腔注射 0.1% CCl4玉米油造模劑 (10 mL/kg) 后，模型組肝臟系數(shù)與對照組相比顯著增大，ALT和AST水平也均顯著升高，提示肝臟受損嚴(yán)重造模成功。PEG-rCygb高劑量組肝臟系數(shù)顯著低于 rCygb各濃度組，ALT和 AST水平為其他各組中最低，并且PEG-rCygb各組ALT和AST水平隨濃度增高而下降，表明經(jīng)PEG修飾后的rCygb對肝臟受損的改善作用更明顯。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，由氧自由基或反應(yīng)性氧化產(chǎn)物 (ROS) 與膜磷脂的多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生，可繼續(xù)與膜蛋白作用產(chǎn)生交聯(lián)，破壞膜結(jié)構(gòu)，最終使細(xì)胞膜失去生物功能。常作為評價(jià)脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)。超氧陰離子自由基 (O2-) 是活性氧生成過程中的初始產(chǎn)物，T-SOD是超氧陰離子歧化反應(yīng)的催化劑，在體內(nèi)氧化損傷過程中起重要的清毒作用。作為機(jī)體氧化損傷的酶清除劑，T-SOD可減少機(jī)體氧自由基的積累，緩解肝細(xì)胞損傷。CAT是一種金屬蛋白酶，是機(jī)體抗氧化損傷的酶清除劑，可催化過氧化氫分解為水和氧氣。CAT活力的高低直接反應(yīng)出其對機(jī)體的保護(hù)能力。自由基的過快生成導(dǎo)致T-SOD和CAT等酶清除劑大量消耗，T-SOD和CAT的活力越高，說明機(jī)體清除毒性氧自由基的能力就越強(qiáng)，對肝損傷的保護(hù)作用越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG-rCygb能顯著降低MDA含量，升高T-SOD和CAT活性，提示 PEG-rCygb可通過清除羥自由基和超氧陰離子自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

肝星狀細(xì)胞的增殖和激活是肝損傷向肝纖維化轉(zhuǎn)變的中心環(huán)節(jié)[16]，各種致纖維化因素均以HSC為靶點(diǎn)，使其活化，活化的HSC產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)，ECM在肝臟內(nèi)大量沉積，最終形成肝纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，給藥 24 h后PEG-rCygb各濃度組RGR較正常對照組無顯著差異，提示經(jīng)PEG修飾后rCygb抗HSC增殖能力增強(qiáng)，且無 HSC細(xì)胞毒性。細(xì)胞氧化應(yīng)激模型也顯示，PEG-rCygb高濃度組 (25、50、100 mm/L) RGR顯著高于模型組及rCygb各相對應(yīng)濃度組。說明經(jīng)PEG修飾后rCygb的抗氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，進(jìn)而抑制HSC細(xì)胞增殖[2]。

上述結(jié)果顯示，經(jīng)PEG修飾后的rCygb清除機(jī)體自由基的能力增強(qiáng)，抗 HSC氧化應(yīng)激的能力提高，且無HSC細(xì)胞毒性，分析通過PEG修飾，一方面rCygb分子排阻體積顯著增大，腎臟清除率明顯下降，另一方面 PEG分子具有結(jié)構(gòu)特異性，PEG修飾后的rCygb對肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)有抗性，使得網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對rCygb的識別攝取和清除能力降低，并且rCygb經(jīng)PEG修飾后其誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體以及與抗體結(jié)合的能力降低或消除，使其難以被免疫系統(tǒng)識別和清除，從而有效延長了rCygb在體內(nèi)的半衰期。此外，PEG鏈的空間位阻作用使得rCygb對蛋白酶酶解的抵抗能力大為增加，進(jìn)而增加了rCygb的生物穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)其清除機(jī)體自由基的能力，改善肝臟內(nèi)環(huán)境，達(dá)到抗肝損傷的作用。但是對于PEG增強(qiáng)rCygb藥效作用的具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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Protective effects of PEG modified recombinant cytoglobin on acute liver injury in mice

Zhaofa Li1,2, Xiaoying Deng1,2, Jiajia Xu1,2, and Wenchang Lian1,2

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2Molecular Medicine Engineering Research Center of the Ministry of Education,Quanzhou362021,Fujian,China

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Received:February 20, 2012;Accepted:September 6, 2012

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