轉(zhuǎn)哺乳動(dòng)物cyp2e1基因煙草植株再生及其分析

李佩菡，向太和，謝軍，馮婷，陸文怡

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

轉(zhuǎn)哺乳動(dòng)物cyp2e1基因煙草植株再生及其分析

李佩菡，向太和，謝軍，馮婷，陸文怡

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036

哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞中cyp2e1基因所編碼的蛋白CYP2E1在代謝異型有機(jī)物方面起著重要作用，轉(zhuǎn)cyp2e1基因植物可以代謝多種小分子有機(jī)污染物；但cyp2e1基因在植物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控和代謝機(jī)理尚不完全清楚。文中將含有cyp2e1基因的質(zhì)粒pSLD50-6和對(duì)照gus基因的質(zhì)粒pKH200轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)將cyp2e1基因和對(duì)照gus基因成功轉(zhuǎn)入煙草，分別獲得了轉(zhuǎn)cyp2e1和gus基因再生植株。選取PCR鑒定的再生植株進(jìn)行熒光定量PCR (qRT-PCR) 分析，結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)錄水平上，轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草中，乙醇處理后cyp2e1基因的表達(dá)明顯下降，苯和甲苯處理后cyp2e1基因的表達(dá)量稍有下降；而丙酮、甲醛處理和缺氧條件下cyp2e1基因的表達(dá)有不同程度的升高。此外，苯處理后，轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草中NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5酶的基因活性顯著提高，說明煙草中NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5酶與CYP2E1酶的解毒過程有關(guān)，可能起到哺乳動(dòng)物體內(nèi)的NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5的功能，參與CYP2E1酶催化過程的電子傳遞鏈。

煙草，cyp2e1基因，NADPH-P450酶，細(xì)胞色素b5，表達(dá)

Abstract:CYP2E1 enzyme encoded bycyp2e1gene plays an important role in metabolism of heterogeneous organics inmammalian liver cells. The transgenic plant withcyp2e1can metabolize various low molecular weight organic pollutants.However, it is unclear the mechanism of expression control ofcyp2e1in transgenic plant. In this study, plasmid pSLD50-6 withcyp2e1and pKH200 withgusas control were transformed intoAgrobacterium tumefaciensGV3101 separately. Then,thecyp2e1orgusgenes were transferred into tobacco (Nicotiana tabacum) and the transgenic plants were regenerated viaAgrobacterium tumefaciensmethod. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze thecyp2e1gene expression. The expression ofcyp2e1in transgenic tobacco withcyp2e1decreased obviously treated by ethyl alcohol and reduced slightly by benzene and toluene, while it enhanced by acetone, formaldehyde and oxygen deficit in different levels.In addition, the gene expression of NADPH-P450 oxidoreductase and cytochrome b5 enzyme in the transgenic tobacco withcyp2e1were increased significantly treated by benzene, which showed that NADPH-P450 oxidoreductase and cytochrome b5 enzyme in transgenic tobacco have relation with CYP2E1 detoxication process. It suggested that the NADPH-P450 oxidoreductase and cytochrome b5 enzyme in transgenic plant formed the requirement in mammalian and participated in the electron transport chain ofCYP2E1 enzyme catalytic process.

Keywords:tobacco (Nicotiana tabacum),cyp2e1gene, NADPH-P450 oxidoreductase, cytochrome b5, expression

細(xì)胞色素P450是一類與重金屬結(jié)合的血紅蛋白，在代謝異型有機(jī)物方面起著重要作用；其中，CYP2E1作為 P450酶家族中的成員之一，主要分布在哺乳動(dòng)物肝臟中，具有非常重要的解毒功能[1-3]。美國華盛頓大學(xué)Doty課題組先后將細(xì)胞色素 P450 2E1基因 (cyp2e1) 轉(zhuǎn)入到煙草Nicotiana tabacum、顛茄Atropa belladonna和楊樹Hybrid poplar中，轉(zhuǎn)基因煙草和楊樹再生植株以及顛茄的毛狀根能夠高效分解苯、甲苯、三氯乙烯、三氯甲烷、四氯化碳和二氯乙烯等有機(jī)污染物[4-8]。Zhang等利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因法，將cyp2e1基因轉(zhuǎn)入花卉植物矮牽牛Petunia hybrida，轉(zhuǎn)基因矮牽牛提高了對(duì)苯、甲苯的吸收能力，并提高了對(duì)甲醛的抗性[9]。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，影響CYP2E1酶的因素有很多，其中它的誘導(dǎo)劑有乙醇、異丙醇、丙酮、乙醚、苯、甲苯、甲醛、吡唑和異煙肼等；此外，缺氧等環(huán)境因素誘導(dǎo)cyp2e1基因的表達(dá)，肥胖和患糖尿病時(shí)CYP2E1的活性增高[10-14]。而且，從代謝途徑看，CYP2E1酶對(duì)異型有機(jī)物的代謝過程中，需要NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素 (Cytochrome) b5作為電子傳遞參與其中[15-17]；但cyp2e1基因在植物體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控和代謝機(jī)理尚不完全清楚[4,6]。

本研究利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)將cyp2e1基因轉(zhuǎn)入煙草，分析了外源基因cyp2e1在轉(zhuǎn)基因再生植物后代中的分離情況，并分析了不同環(huán)境因子對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)影響以及轉(zhuǎn)基因煙草中植物內(nèi)源性 NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色b5的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草品種為黃苗榆。含有哺乳動(dòng)物兔肝細(xì)胞cyp2e1基因的質(zhì)粒pSLD50-6和含gus基因的質(zhì)粒pKH200由華盛頓大學(xué)Doty博士友情惠贈(zèng)。cyp2e1基因和gus基因均由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，質(zhì)粒pSLD50-6和pKH200都含有Kan (卡那霉素)抗性基因[6]。

1.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化

煙草種子放入1.5 mL離心管中，用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗3次后，再用0.1%的升汞滅菌5 min，無菌水沖洗3次，最后用無菌的濾紙吸干種子表面水分，接種到MS固體培養(yǎng)基上。取萌發(fā)生長30 d后的無菌苗葉片作為轉(zhuǎn)基因的受體。

通過凍融法將質(zhì)粒pSLD50-6和pKH200分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101。參考王琳和向太和的方法[18]，稍作改進(jìn)，對(duì)煙草無菌苗葉片進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，具體步驟是：1) 含cyp2e1的質(zhì)粒pSLD50-6和含gus基因的質(zhì)粒 pKH200的根癌農(nóng)桿菌分別劃線培養(yǎng)在LB+Kan 50 mg/L+Rif (利福平) 40 mg/L的培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。挑取單菌落過夜培養(yǎng)于LB+Kan 50 mg/L+Rif 40 mg/L的液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200～250 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)農(nóng)桿菌生長密度OD600約為0.5時(shí)，取1 mL菌液放入無菌的1.5 mL離心管中，離心，除上清，用MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體并稀釋至OD600約為0.1，用作侵染液。2) 將煙草無菌苗葉片切成約1 cm2的小塊，用無菌的手術(shù)刀劃出傷口，轉(zhuǎn)入MS+0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2～3 d。3) 將預(yù)培養(yǎng)的煙草葉片放在已制備好的農(nóng)桿菌侵染液中，室溫下80～100 r/min搖床振蕩8 min。4) 用無菌的濾紙把煙草葉片表面的農(nóng)桿菌菌液吸干，轉(zhuǎn)入MS+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)2～3 d。5) 共培養(yǎng)后的葉片放在MS+0.5 mg/L 6-BA +500 mg/L Cef (頭孢霉素) 的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)30 min，80～100 r/min；隨后，用無菌的濾紙吸干液體，將葉片轉(zhuǎn)入 MS+0.5 mg/L 6-BA +80 mg/L Kan+500 mg/L Cef的篩選培養(yǎng)基上；分化出的芽轉(zhuǎn)移到不含任何植物激素的MS(0)培養(yǎng)基上生根。6) 再生植株生長到 5 cm以上后，打開培養(yǎng)瓶蓋煉苗3 d，移栽裝有培養(yǎng)土 (培養(yǎng)土的成分是草木灰∶蛭石∶珍珠巖，V/V=6∶3∶1) 的盆缽中，放入杭州師范大學(xué)人工氣候室中生長。利用同樣的方法獲得對(duì)照煙草轉(zhuǎn)gus基因的再生植株。

1.3 轉(zhuǎn)基因煙草再生植株的鑒定分析

1.3.1 轉(zhuǎn)基因煙草再生植株P(guān)CR分析

利用上海 Sangon公司的植物基因組提取試劑盒提取煙草的基因組DNA。根據(jù)cyp2e1基因(GenBank Accession No. M15061) 和gus基因(GenBank Accession No. AF354045) 序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增cyp2e1基因和gus基因的引物：cyp2e1-P1：5￠-TGAAGGGTGTGCAGCCGATGA CAA-3￠，cyp2e1-P2：5￠-CATCGGGAATCTTCTCC AGTTGG-3￠和 gus-P1：5￠-CTGCGACGCTCAC ACCGAT-3￠，gus-P2：5￠-TCACCGAAGTTCATG CCAGTCCAG-3￠，引物由上海Sangon公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體積為 35 μL，其中包括 2 μL 0.1 mmol/L的 dNTPs (德國 Roche公司)，2 μL 10 pmol/L的PCR引物，2 UTaqDNA聚合酶 (美國Promega公司) 和約50 ng基因組DNA。用美國ABI公司PE9700型DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃90s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，隨后于4 ℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳1.5 h (5 V/cm)，溴化乙錠 (EtBr)染色，用美國Bio/Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草再生植株cyp2e1基因的熒光定量PCR分析

用RNA提取試劑盒 (日本TaKaRa公司) 提取轉(zhuǎn)cyp2e1和gus基因植株和對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株葉片 mRNA，用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TaKaRa公司) 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)煙草actin基因序列 (GenBank Accession No. GQ339768) 設(shè)計(jì)引物 actin-F：5￠-CACGCCA TTCTTCGTTTGGA-3￠，actin-R：5￠-GGACAATT TCCCGTTCAGCAG-3￠，預(yù)期擴(kuò)增長度為 112 bp，擴(kuò)增結(jié)果作為內(nèi)參。根據(jù)cyp2e1基因序列(GenBank Accession No. M15061) 設(shè)計(jì)引物

cyp2e1-F：5￠-ATTCCCAAGTCCTTTGGCAGGA-3￠和 cyp2e1-R：5￠-TGTGGTTCAACAGCATCTCC C-3￠，預(yù)期擴(kuò)增長度為 124 bp。用 ROCHE LIGHTCYCLER 480熒光定量 PCR儀進(jìn)行cyp2e1基因的定量擴(kuò)增分析。熒光定量PCR條件是：起始95 ℃ 2 min ；隨后 95 ℃30s、59 ℃30s、72 ℃20s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；結(jié)束后在4 ℃保存。參考 Livak和 Schmittgen的方法計(jì)算cyp2e1基因相對(duì)表達(dá)量[19]，即：相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，其中Ct為樣品管的熒光信號(hào)達(dá)到某一固定閾值的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

1.3.3 Southern blotting

同 1.3.1中的方法大量提取轉(zhuǎn)基因煙草植株基因組DNA，選用EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切后轉(zhuǎn)膜。從質(zhì)粒pSLD50-6中擴(kuò)增cyp2e1基因的片段，擴(kuò)增出的產(chǎn)物用上海Sangon公司DNA分離試劑盒進(jìn)行純化，再用Roche公司高效地高辛 DNA標(biāo)記試劑盒 (DIG high prime) 制備探針，利用地高辛發(fā)光檢測試劑盒(DIG luminescent detection kit) 進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4 Western blotting

利用 Roche公司蛋白抽提試劑盒抽提總蛋白質(zhì)。取50 μL按照上海博彩生物科技有限公司BCA蛋白定量分析試劑盒說明書操作，進(jìn)行蛋白定量。配制15%的分離膠和5%的濃縮膠。根據(jù)順序加樣，每個(gè)樣品上樣量為10 μg抽提蛋白，裝入電泳槽中，打開電源，恒壓100 V開始電泳，運(yùn)行20 min；然后將電壓調(diào)至180 V，運(yùn)行60 min，取出膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

恒壓30 V開始轉(zhuǎn)膜，運(yùn)行16 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜放在5%脫脂奶粉中封閉，放入反應(yīng)盒中備用。美國BD Genetest公司的CYP2E1酶鼠抗體用5%脫脂奶粉稀釋 (1∶1 000)，加入反應(yīng)盒中，室溫緩搖2 h。用PBST洗去未結(jié)合的一抗，每次10 min，洗4次。二抗 (HRP) 用5%脫脂奶粉稀釋 (1∶1 000)，加入反應(yīng)盒中，室溫緩搖1 h。用PBST洗去未結(jié)合的二抗，每次10 min，洗4次。在離心管中按照每1 mL ECL-PLUS顯色液，加入膜上 (有蛋白的一面)，反應(yīng)5 min，X-film曝光顯色。

1.3.5cyp2e1基因在轉(zhuǎn)基因煙草再生植株后代中的分離分析

再生植株自花授粉所結(jié)種子播于盆缽中，在人工氣候室里種子萌發(fā)生長至2片真葉以上，取小植株 (T1代) 葉片同1.3.1的方法，提取基因組DNA和進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 不同環(huán)境條件下轉(zhuǎn)基因煙草cyp2e1基因的表達(dá)分析

在 20 mL的揮發(fā)性有機(jī)物分析瓶 (Volatile organic analysis vial，簡稱 VOA，美國 Aglient公司) 內(nèi)盛放5 mL MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別含有 8 μg/mL 乙醇、80 μg/mL 丙酮、10 μg/mL苯、10 μg/mL甲苯、50 μg/mL甲醛。乙醇等分別在高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右加入。剪取帶2片葉的轉(zhuǎn)基因苗，接入VOA瓶中，培養(yǎng)7 d后，取葉片提取mRNA。同時(shí)，培養(yǎng)在MS固體培養(yǎng)基上帶2片葉的苗加入無菌水浸沒過植株頂端進(jìn)行缺氧處理 (水淹)，12 h后，提取葉片mRNA。熒光定量PCR檢測cyp2e1基因的表達(dá)，熒光定量PCR方法同1.3.2。

1.5 轉(zhuǎn)基因煙草中NADPH-P450氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因的表達(dá)分析

根據(jù)煙草 NADPH-P450氧化還原酶基因(GenBank Accession No. AB004307) 和cytochrome b5基因 (GenBank Accession No.X71441) 序列，設(shè)計(jì)熒光定量 PCR擴(kuò)增引物：NADPH-F：5￠-CCCAAATGCCACACACATCA-3￠,NADPH-R：5￠-CCCAAGGAAAAGCCAAGCA-3￠和 b5-F：5￠-CTCCTCCCAATCAGCCTCATT-3￠，b5-R：5￠-GCCAAAAGCAACACCCAAAA-3￠，預(yù)期分別擴(kuò)增出127 bp和124 bp長度的片段。同1.3.2的方法，以actin基因作為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR分析。

在超凈工作臺(tái)上切取稱量相同質(zhì)量 (1g) 的轉(zhuǎn)cyp2e1基因無菌苗葉片、對(duì)照轉(zhuǎn)gus基因和非轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片，放入含有MS培養(yǎng)基的VOA瓶中，在VOA瓶中用微量加樣器加入苯，使培養(yǎng)基中苯終濃度達(dá)1 μg/mL苯，24 h后提取經(jīng)過苯處理和未經(jīng)過處理的葉片 mRNA，進(jìn)行NADPH-P450氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因熒光定量PCR分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草植株再生

煙草無菌苗離體葉片在根癌農(nóng)桿菌侵染30 d左右在篩選培養(yǎng)基上分化出單個(gè)芽或芽叢(圖1A)。待再生芽長至2 cm以上切下轉(zhuǎn)到MS(0)培養(yǎng)基上，在7 d左右即能生根 (圖1B)。經(jīng)過煉苗，移栽到含有培養(yǎng)土的盆缽中 (圖 1C)，能正常生長 (圖1D)，移栽100 d左右能開花結(jié)實(shí)(圖 1E)。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草再生植株的PCR鑒定

利用cyp2e1基因引物 cyp2e1-P1和cyp2e1-P2對(duì)獲得再生植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在獲得的59株再生植株中，其中35株擴(kuò)增出預(yù)期大小410 bp的條帶 (圖2)，初步確定cyp2e1基因成功轉(zhuǎn)入煙草植株。

2.3 轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草的熒光定量PCR分析

隨機(jī)選取PCR檢測陽性的4個(gè)株系 (TL01、TL03、TL15和TL26)、1株轉(zhuǎn)gus基因煙草植株、1株野生型煙草進(jìn)行目的基因cyp2e1實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)gus基因植株和野生型植株均沒有檢測到cyp2e1基因的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)cyp2e1基因的4個(gè)株系中，外源cyp2e1基因均有不同程度的表達(dá) (圖3)。

2.4 Southern blotting和Western blotting分析

Southern blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)cyp2e1煙草4個(gè)株系TL01、TL03、TL15和TL26分別雜交出2個(gè)或2個(gè)以上的條帶、對(duì)照野生型煙草和轉(zhuǎn)gus基因煙草植株無雜交條帶，說明外源基因以多拷貝的形式存在于轉(zhuǎn)基因植株的基因組中(圖 4)。Western blotting結(jié)果顯示，4個(gè)株系TL01、TL03、TL15和TL26均雜交出預(yù)期大小56.2 kDa條帶 (圖5)，表明轉(zhuǎn)入的外源基因在煙草中實(shí)現(xiàn)了正常編碼表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草植株再生過程Fig.1 The transgenic plant withcyp2e1gene regeneration. (A) Buds differentiated from leaf. (B) Plantlet regeneration. (C) Plant transplanted in soil. (D) Plant growth normally in soil. (E) Plant flowering normally.

2.5cyp2e1基因在轉(zhuǎn)基因后代中的分離情況分析

經(jīng)過多重鑒定的 4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系 TL01、TL03、TL15和TL26均能正常開花，其中TL01、TL03和TL26自花正常結(jié)實(shí)，而TL15未能獲得種子。經(jīng)過PCR檢測，cyp2e1基因在TL01、TL03和TL26 3個(gè)株系后代中出現(xiàn)了分離，其分離比分別是 51∶9 (17∶3) 、48∶12 (4∶1) 和 34∶26 (17∶13)，均不符合3∶1的比例，這可能與轉(zhuǎn)基因植株基因組中外源基因是多拷貝以及外源基因插入的位置效應(yīng)有關(guān)。已有不少報(bào)道指出在轉(zhuǎn)基因植物后代中轉(zhuǎn)入的外源基因異常分離的情況經(jīng)常出現(xiàn)[20]。

圖2 利用cyp2e1基因引物對(duì)煙草再生植株進(jìn)行基因組DNA PCR擴(kuò)增的結(jié)果Fig.2 PCR amplification of transgenic plant genomic DNA with primers fromcyp2e1gene. M: DSTM2000 DNA marker (Dongsheng Biotechnology Co.); 1:pSLD50-6 plasmid; 2: non-transgenic plant (wild-type);3?37: transgenic plants withcyp2e1gene.

圖3 轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草再生植株熒光定量PCR分析Fig.3 Real-time quantitative PCR analysis ofcyp2e1gene expression in transgenic plants. 1: non-transgenic plant (wild-type); 2: thetransgenic plants withgusgene;3?6: thecyp2e1transgenic plant individuals of TL01,TL03, TL15 and TL26.

圖4 Southern blotting分析轉(zhuǎn)cyp2e1煙草植株Fig.4 Southern blotting analysis ofcyp2e1transgenic plants. 1?4: thecyp2e1transgenic plant individuals of TL01, TL03, TL15 and TL26; 5: non-transgenic plant(wild-type); 6: thegustransgenic plants.

2.6 不同環(huán)境因子條件下cyp2e1基因的表達(dá)

選取cyp2e1基因表達(dá)量較高和較低的株系TL01和TL03放在分別含苯、甲苯、乙醇和丙酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d、浸沒水中12 h進(jìn)行缺氧處理后，再對(duì)其進(jìn)行熒光定量 PCR分析。兩個(gè)株系的結(jié)果相一致，與對(duì)照相比，乙醇處理后cyp2e1基因的表達(dá)明顯下降，苯和甲苯處理后cyp2e1基因的表達(dá)量稍有下降；而丙酮、甲醛處理和缺氧條件下cyp2e1基因的表達(dá)有不同程度的升高 (圖6)。

圖5 Western blotting分析轉(zhuǎn)cyp2e1煙草植株Fig.5 Western blotting analysis ofcyp2e1transgenic plants. M: protein marker (MBI Co.); 1: non-transgenic plant (wild-type); 2: thegustransgenic plants; 3-6: thecyp2e1transgenic plant individuals of TL01, TL03,TL15 and TL26.

圖6 不同環(huán)境因子條件下轉(zhuǎn)基因植株cyp2e1基因的表達(dá)分析Fig.6 Expression ofcyp2e1gene of transgenic plant treated with different factors. 1: non-treatment; 2: treated with ethyl alcohol; 3: treated with acetone; 4: treated with formaldehyde; 5: treated with benzene; 6: treated with toluene; 7: treated with oxygen deficit.

2.7 轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5的表達(dá)分析

熒光定量 PCR分析結(jié)果顯示，煙草內(nèi)源性NADPH-P450氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因在野生型煙草、轉(zhuǎn)gus煙草和轉(zhuǎn)cyp2e1煙草中表達(dá)量沒有明顯差異。經(jīng)過苯處理后，轉(zhuǎn)cyp2e1煙草中 NADPH-P450氧化還原酶基因的表達(dá)顯著升高，與野生型和轉(zhuǎn)gus煙草相比提高達(dá)4倍以上；細(xì)胞色素b5基因表達(dá)量比野生型和轉(zhuǎn)gus煙草升高2倍以上 (圖7)。

圖7 轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草中NADPH-P450氧化還原酶基因和細(xì)胞色素b5基因表達(dá)情況Fig.7 Expression of NADPH-P450 oxidoreductase gene and cytochrome b5 gene incyp2e1transgenic plant. 1:non-transgenic plant (wild-type); 2: thegustransgenic plant; 3: thetransgenic plant TL01; 4: thetransgenic plant TL03;5: thetransgenic plant TL15; 6: thetransgenic plant TL26; 7: non-transgenic plants (wild-type) treated with benzene; 8:thegustransgenic plants treated with benzene; 9: thetransgenic plant TL01 treated with benzene; 10: thetransgenic plant TL03 treated with benzene; 11: thetransgenic plant TL15 treated with benzene; 12: thetransgenic plant TL26 treated with benzene.

3 討論

CYP2E1作為 P450酶家族中的成員之一，存在于哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞中，對(duì)許多小分子有機(jī)化合物有分解能力[1-3]。cyp2e1基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)表現(xiàn)出與動(dòng)物體內(nèi)相似的解毒功能，轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草、顛茄、楊樹和矮牽牛等提高了對(duì)苯、甲苯、氯仿 (三氯甲烷)、四氯化碳、三氯乙烯、二溴化乙烯、氯乙烯、溴二氯甲烷等有機(jī)小分子污染物的吸收分解能力[4-8]；并提高了對(duì)甲醛的抗性[9]，在植物環(huán)境修復(fù)中具有應(yīng)用前景。此外，細(xì)胞色素P450基因家族的其他系列基因，如cyp1a1、cyp2b6和cyp2c19轉(zhuǎn)入水稻后，提高了水稻對(duì)除草劑異丙甲草胺、莠去津的耐受能力，并且可以降低環(huán)境中的除草劑濃度[21]。

在哺乳動(dòng)物包括人類中，P450基因的表達(dá)有多種調(diào)控方式，分為轉(zhuǎn)錄水平、加工和mRNA穩(wěn)定以及翻譯和酶穩(wěn)定等調(diào)控類型。其中，cyp2e1的表達(dá)受乙醇、異丙醇、丙酮、乙醚、苯、甲苯、甲醛、吡唑和異煙肼等小分子有機(jī)物的誘導(dǎo)；并受缺氧、禁食、多尿癥、肥胖和糖尿病等生理狀態(tài)的誘導(dǎo)[10-14]。

本研究獲得的轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草，熒光定量PCR分析顯示，在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上，乙醇處理后cyp2e1基因的表達(dá)明顯下降；苯和甲苯處理后cyp2e1基因的表達(dá)量稍有下降；而丙酮、甲醛處理和缺氧條件下cyp2e1基因的表達(dá)有不同程度的升高。其中，丙酮、甲醛和缺氧環(huán)境對(duì)cyp2e1基因表達(dá)的影響與哺乳動(dòng)物相似，而乙醇、苯和甲苯對(duì)cyp2e1表達(dá)的影響與哺乳動(dòng)物不同，即：在植物體內(nèi)，外界因子對(duì)cyp2e1的調(diào)控與哺育動(dòng)物體內(nèi)不完全相同，這可能與植物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在不同的調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)。由于乙醇、丙酮是植物體內(nèi)糖和脂肪代謝的中間產(chǎn)物，缺氧是植物脅迫環(huán)境的種類之一，苯、甲苯和甲醛是常見的環(huán)境污染物，因此，本研究結(jié)果可為調(diào)控和提高cyp2e1基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)提供參考。

另外，在哺乳動(dòng)物中，CYP2E1酶的催化過程需要電子傳遞鏈中 NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5的互作[15-17]。在轉(zhuǎn)cyp2e1基因植物中，并沒有同時(shí)轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5基因，但在植物體內(nèi) CYP2E1酶同樣具有分解小分子污染物的功能，這一直是個(gè)很不明確的問題[4,6]。本研究結(jié)果顯示，苯處理后，轉(zhuǎn)cyp2e1基因煙草NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素b5酶的基因活性顯著提高，這說明煙草中內(nèi)源性的NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素 b5酶與CYP2E1酶的解毒過程有關(guān)，可能起到哺乳動(dòng)物體內(nèi)的 NADPH-P450氧化還原酶和細(xì)胞色素 b5的功能，參與CYP2E1酶催化過程的電子傳遞鏈。

REFERENCES

[1] Lee SST, Buters JTM, Pineau T, et al. Role of CYP2E1 in the hepatotoxicity of acetaminophen. J Biol Chem, 1996, 271(20): 12063?12067.

[2] Lieber CS. Cytochrome P-4502E1: its physiological and pathological role. Physiol Rev,1997, 77(2): 517?544.

[3] Gonzalez FJ. The 2006 Bernard B. Brodie Award Lecture. CYP2E1. Drug Metab Dispos, 2007,35(1): 1?8.

[4] Doty SL, Shang QT, Wilson AM, et al. Enhanced metabolism of halogenated hydrocarbons in transgenic plants containing mammalian cytochrome P450 2E1. Proc Natl Acad Sci USA,2000, 97(12): 6287?6291.

[5] Banerjee S, Shang TQ, Wilson AM, et al.Expression of functional mammalian P450 2E1 in hairy root cultures. Biotechnol Bioeng, 2002,77(40): 462–466.

[6] Doty SL, James CA, Moore AL, et al. Enhanced phytoremediation of volatile environmental pollutants with transgenic trees. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(43): 16816?16821.

[7] James CA, Xin G, Doty SL, et al. Degradation of low molecular weight volatile organic compounds by plants genetically modified with mammalian cytochrome P450 2E1. Environ Sci Technol, 2008,42(1): 289?293.

[8] Kang JW, Wilkerson HW, Farin FM, et al.Mammalian cytochrome CYP2E1 triggered differential gene regulation in response to trichloroethylene (TCE) in a transgenic poplar.Funct Integr Genomics, 2010, 10(3): 417?424.

[9] Zhang DX, Xiang TH, Li PH, et al. Transgenic plants ofPetunia hybridaharboring theCYP2E1gene efficiently remove benzene and toluene pollutants and improve resistance to formaldehyde.Genet Mol Biol, 2011, 34(4): 634?639.

[10] Yang CS, Yoo JS, Ishizaki H, et al. CytochromeP450IIE1: roles in nitrosamine metabolism and mechanisms of regulation. Drug Metab Rev, 1990,22(2/3): 147?159.

[11] Ding X, Peng HM, Pernecky SJ, et al. Induction of P-450 cytochromes 2E2, 1A1, and 1A2 by imidazole in neonatal rabbits. Drug Metab Dispos,1992, 20(6): 792?796.

[12] Hu Y, Ingelman-Sundberg M, Lindros KO.Induction mechanisms of cytochrome P450 2E1 in liver: interplay between ethanol treatment and starvation. Biochem Pharmacol, 1995, 50(2):155?161.

[13] Carpenter SP, Lasker JM, Raucy JL. Expression,induction, and catalytic activity of the ethanol-inducible cytochrome P450 (CYP2E1) in human fetal liver and hepatocytes. Mol Pharmacol,1996, 49(2): 260?268.

[14] Peng HM, Coon MJ. Regulation of rabbit cytochrome P450 2E1 expression in HepG2 cells by insulin and thyroid hormone. Mol Pharmacol,1998, 54(4): 740?747.

[15] Yamazaki H, Nakano M, Gillam EM, et al.Requirements for cytochrome b5 in the oxidation of 7-ethoxycoumarin, chlorzoxazone, aniline, and N-nitrosodimethylamine by recombinant cytochrome P450 2E1 and by human liver microsomes. Biochem Pharmacol, 1996, 52(2):301?309.

[16] Shiota N, Nagasawa A, Sakaki T, et al.Herbicide-resistant tobacco plants expressing the fused enzyme between rat cytochrome P4501A1(CYP1A1) and yeast NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase. Plant Physiol, 1994, 106(1):17?23.

[17] Shiota N, Kodama S, Inui H, et al. Expression of human cytochromes P450 1A1 and P450 1A2 as fused enzymes with yeast NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in transgenic tobacco plants.Biosci Biotechnol Biochem, 2000, 64(10):2025?2033.

[18] Wang L, Xiang TH. Cloning of flavonoid-3',5'-hydroxylase gene (F3', 5'H) ofPetunia hybridaand construction of a novel vector expression F3',5'H driven by flower-specific promoter. J Trop Subtrop Bot, 2009, 17(4): 358?364.

王琳, 向太和. 矮牽牛 F3￠, 5￠H 全長 cDNA的克隆及花特異啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2009, 17(4): 358?364.

[19] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods, 2001, 25(4):402?408.

[20] Dong LY, Zhang J, Wang PW, et al. The inheritance of foreign genes in the progenies of transgenic plants and research progress. Mol Plant Breed (Online), 2011, 9(18): 1127?1133.

董靈艷, 張君, 王丕武, 等. 外源基因在轉(zhuǎn)基因植物后代中的遺傳規(guī)律及研究進(jìn)展. 分子植物育種 (網(wǎng)絡(luò)版), 2011, 9(18): 1127?1133.

[21] Kawahigashi H, Hirose S, Ohkawa H, et al.Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolachlor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19. J Agric Food Chem, 2006, 54(8): 2985?2991.

Transgenic plant regeneration of tobacco(Nicotiana tabacum)haboring mammaliancyp2e1gene

Peihan Li, Taihe Xiang, Jun Xie, Ting Feng, and Wenyi Lu

College of Life and Environment Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou310036,Zhejiang,China

李佩菡, 向太和, 謝軍, 等. 轉(zhuǎn)哺乳動(dòng)物cyp2e1基因煙草植株再生及其分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(10): 1195?1204.

Li PH, Xiang TH, Xie J, et al. Transgenic plant regeneration of tobacco (Nicotiana tabacum) haboring mammaliancyp2e1gene. Chin J Biotech, 2012, 28(10): 1195?1204.

Received:January 16, 2012;Accepted:September 4, 2012

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Corresponding author:Taihe Xiang. Tel/Fax: +86-571-28865327; E-mail: xthcn@163.com

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