劉金華,史艷宇,馬路遙,魏春艷,邵麗筠,王海龍
(1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林 長(zhǎng)春 130062;2.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,吉林 長(zhǎng)春 130022;3.吉林大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室,吉林 長(zhǎng)春 130021;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗公安局,內(nèi)蒙古 烏里雅斯太 026300;5.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130021)
近年來(lái)全球有關(guān)食品安全的惡性事件頻發(fā),食源性致病菌成為威脅食品安全的主要元兇。其中金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、空腸彎曲桿菌、副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌(傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌)、產(chǎn)氣莢膜梭菌及變形桿菌等引起的食源性疾病居于世界前列[1]。傳統(tǒng)的致病菌檢測(cè)均采用生理生化、血清型水平的方法,試驗(yàn)周期長(zhǎng),耗時(shí)費(fèi)力,且靈敏度受限,因此有必要建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)手段[2-3]。多重PCR檢測(cè)方法因其能夠一次對(duì)多種致病菌同時(shí)檢測(cè),而成為研究熱點(diǎn)[4-6]。本研究擬建立一種多重PCR檢測(cè)方法能夠同時(shí)檢測(cè)出單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、副溶血性弧菌及普通變形桿菌4種腸道致病菌,旨在為臨床疾病診斷、食品安全檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)控等工作提供良好的有效檢測(cè)方法。
1.1 菌種及其來(lái)源
副溶血性弧菌(Vibiroparahaemolyticus,ATCC17802)、普通變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris,ATCC33420)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus,ATCC11778)購(gòu)于北京蘭博瑞公司。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,ATCC19111)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi,ATCC13311)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(分離株)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis,ATCC13076)、志賀氏菌(Shigella)(分離株)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni,ATCC33291)及大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157) 保存于吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。
1.2 主要試劑與儀器
DNA 提取試劑盒(Easy PureTMGenomic DNA Extraction Kit、PCR 試劑(TransStart Taq DNA Polymerase 及100 bp DNA Ladder Marker)均為北京全式金生物有限公司產(chǎn)品;營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA) 血平板、溶菌肉湯(luria-bertani,LB) 液體培養(yǎng)基和革蘭陰性增菌液均為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司成品配制。
恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)、恒溫水浴箱(美國(guó)SHELLAB公司),離心機(jī)3K30型(德國(guó)Sigma公司)、梯度PCR 儀ProS型(德國(guó)Eppendorf公司)、PowerPac Universal 164-5070 電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、EC紫外成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 菌株培養(yǎng) 大腸桿菌O157、變形桿菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng),然后挑取2~4個(gè)菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基,在培養(yǎng)箱經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)24 h。單核細(xì)胞增生李斯特菌用TSA 血平板37℃過(guò)夜培養(yǎng),取2~4個(gè)菌落接種到LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h。副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃培養(yǎng)24 h,然后挑取2~4個(gè)菌落接種到氯化鈉結(jié)晶紫增菌液,37℃增菌8~16 h。
1.3.2 DNA 的提取 細(xì)菌DNA 的提取按照Easy PureTMGenomic DNA Extraction Kit使用說(shuō)明中的操作規(guī)程進(jìn)行提取。
1.3.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank中上述4種細(xì)菌的基因序列,通過(guò)序列比對(duì),篩選出4種微生物的特異基因作為靶序列,并根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物。引物的設(shè)計(jì)使用Primer express 2.0軟件進(jìn)行。使用 BLAST 程序,通過(guò) GenBank,對(duì)各引物及擴(kuò)增產(chǎn)物同源性進(jìn)行比對(duì),以保證引物與靶基因結(jié)合的高度特異性。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。序列見(jiàn)表1。
1.3.4 單重PCR擴(kuò)增 先對(duì)上述4種細(xì)菌進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增,反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL(20 ng·L-1),上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1),10×TransStart Taq Buffer 2.5 μL,2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL,TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 μL,ddH2O 補(bǔ)足 總體積至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性 30 s,62℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,34個(gè)循環(huán);72℃ 延伸10 min。
1.3.5 多重PCR擴(kuò)增體系的建立及退火溫度的優(yōu)化 多重PCR的反應(yīng)體系為50 μL 反應(yīng)體系,其中10×buffer 5 μL,Taq酶1.0 μL、dNTP 7.0 μL、Mg2+0.3 μL、上下游引物分別為1.0 μL時(shí),模板:各加3 μL,ddH2O補(bǔ)足到50 μL。多重 PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。其中退火溫度分別為58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃,根據(jù)電泳條帶的亮度確定出最佳退火溫度。
表1 多重PCR引物
1.3.6 多重PCR反應(yīng)的特異性和靈敏性檢測(cè) 多重PCR特異性檢測(cè):分別提取志賀菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌O157的基因組DNA,加入同一反應(yīng)體系,同時(shí)加入本研究中的4種細(xì)菌對(duì)應(yīng)的特異性引物進(jìn)行多重 PCR 擴(kuò)增,以檢測(cè)多重 PCR 的特異性。多重PCR靈敏性檢測(cè):4種菌經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)24 h后,取菌懸液依次10倍進(jìn)行梯度稀釋,然后按照1.3.2 的方法提取DNA,按照優(yōu)化后的多重PCR體系進(jìn)行反應(yīng);同時(shí),取稀釋后的各濃度菌懸液各1 mL,涂在LA平面培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng),進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。多重PCR反應(yīng)能夠檢出的最小DNA量所對(duì)應(yīng)的菌濃度即為該體系的靈敏度。
1.3.7 模擬果汁中細(xì)菌的檢測(cè) 購(gòu)買(mǎi)市售的多種不同品牌果汁,取經(jīng)普通生化培養(yǎng)鑒定大腸桿菌O157、副溶血性弧菌、普通變形桿菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌均為陰性的果汁作為添加的樣品。取各稀釋的菌懸液隨機(jī)混合,加入到陰性果汁中混勻作為模擬樣本。過(guò)夜培養(yǎng),取模擬樣本各1 mL離心后取沉淀物,按1.3.2試劑盒提取核酸,進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。
2.1 單重PCR反應(yīng)的結(jié)果
對(duì)于變形桿菌ureR基因的引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出大小約為522 bp 的特異性片段;用編碼單核細(xì)胞增生李斯特菌hlyA基因的引物進(jìn)行 PCR,擴(kuò)增出大小約為 155 bp 的特異性片段;用編碼大腸桿菌O157的hlyA基因的引物進(jìn)行 PCR,擴(kuò)增出大小約為 366 bp 的特異性片段;用編碼副溶血弧菌氨基酸脫氫酶基因引物進(jìn)行 PCR,擴(kuò)增出大小約為199 bp的特異性片段。
2.2 多重PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化
用梯度PCR儀依次設(shè)定退火溫度為58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃,PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示:64℃對(duì)應(yīng)的條帶最亮也最清晰,說(shuō)明64℃為最佳退火溫度。見(jiàn)圖1。
圖1 多重PCR梯度退火溫度電泳圖
2.3 多重PCR特異性的檢測(cè)結(jié)果
同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)體系中加入10種菌,然后加入本次研究的單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、變形桿菌和副溶血弧菌相應(yīng)的特異性引物。結(jié)果表明:只有該4種菌擴(kuò)增出特異性條帶,其他菌PCR結(jié)果均為陰性。
2.4 多重PCR靈敏度的檢測(cè)結(jié)果
對(duì)菌液進(jìn)行梯度稀釋,然后進(jìn)行多重PCR。結(jié)果顯示:第2條泳帶即稀釋成107倍時(shí)能夠清晰辨別出4條細(xì)菌的特異性條帶,所對(duì)應(yīng)的4種細(xì)菌的菌落計(jì)數(shù)數(shù)量級(jí)為103CFU·mL-1,即本研究中的4重PCR反應(yīng)體系的靈敏度。見(jiàn)圖2。
2.5 應(yīng)用該多重PCR體系檢測(cè)人工染菌果汁
對(duì)模擬果汁樣品的多重PCR檢測(cè)結(jié)果表明:該多重PCR體系可以成功擴(kuò)增出相應(yīng)的目的基因片段,從而識(shí)別出隨機(jī)接種的任意3種菌。見(jiàn)圖3。
圖2 多重PCR靈敏度的檢測(cè)結(jié)果
圖3 多重PCR檢測(cè)果汁中的細(xì)菌
多重PCR反應(yīng)是在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入幾種目的基因的引物,通過(guò)一次反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目的基因的同時(shí)擴(kuò)增[7]。由于在一個(gè)體系中不同的基因組之間、不同引物之間均會(huì)存在相互影響,所以必須對(duì)多重PCR體系進(jìn)行重新優(yōu)化,主要包括反應(yīng)中各組分的濃度[8-10]及退火溫度[8-11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)的方法快速、準(zhǔn)確地確定了最合適的各組分濃度,并對(duì)退火溫度進(jìn)行了摸索。本實(shí)驗(yàn)借助梯度PCR儀,一次性快速確定了最佳的退火溫度。此外PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性取決于引物和模板的匹配程度,本研究中一次性加入多種不同菌的引物,分別擴(kuò)增出相應(yīng)菌的基因片段,實(shí)現(xiàn)了一次PCR同時(shí)檢測(cè)不同病原菌的目的。本實(shí)驗(yàn)對(duì)靈敏度的檢測(cè)結(jié)果與徐曉可等[12]人的多重PCR靈敏度的檢測(cè)結(jié)果相近,高于李盛豐等[13]多重PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果??赡苁怯捎谑褂迷噭┑臄U(kuò)增效果有差異;所選的菌種不同,彼此之間的抑制作用強(qiáng)弱亦不同;體系中各組分的比例、反應(yīng)循環(huán)數(shù)均對(duì)多重PCR的擴(kuò)增效果有影響。多重PCR與傳統(tǒng)的通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定菌的方法相比,具有快速、高效、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn);與普通PCR相比具有高通量的優(yōu)點(diǎn),多重PCR可節(jié)省人力、物力,有助于提高病原菌的檢驗(yàn)效率。
[參考文獻(xiàn)]
[1]汪學(xué)榮,彭祥偉.PCR技術(shù)檢測(cè)肉中食源性病原菌的研究進(jìn)展[J].肉類工業(yè),2010,29(7):52-55.
[2]凌 霞,張敬平.食源性致病菌多重PCR快速檢測(cè)方法建立與應(yīng)用[J].微生物學(xué)雜志,2010,30(4):39-43.
[3]Mekonnen K,Divind E,Ruth-Anne S,et al.A multiplex polymerase chain reaction assay for genus group and species-specific detection of mycobacteria [J].Diagn Microbiol Infect Dis,2004,49(2):99-104.
[4]Ye RW,Wang T,Bedzyk L,et al.Applications of DNA microarrays in microbial systems[J].J Microbiol Methods,2001,47(3):257-272.
[5]Call DR,Borucki MK,Loge F.Detection of bacterial pathogens in environmental samples using DNA microarrays[J].J Microbiol Methods,2003,53(2):235-243.
[6]Kostrzynska M,Bachand A.Application of DNA microarray technology for detection,identification,and characterization of food-borne pathogens [J].Canadian J Microbiol,2006,52(1):1-8.
[7]Panicker G,Call DR,Krug MJ,et al.Detection of pathogenic Vibrio spp.in shell fish by using multiplex PCR and DNA microarrays [J].Appl Environ Microbiol,2004,70(12):7436-7444.
[8]王大勇,方振東,謝朝新,等.食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志,2009,29(5):67-71.
[9]郝玉芹,孫皆宜,李 艾,等.正交優(yōu)化多重 PCR 反應(yīng)體系檢測(cè) 3種食源性致病菌的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(2):602-605.
[10]代 娟,李玉峰,楊 瀟.腸道致病菌多重 PCR 快速檢測(cè)體系研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2007,23( 2):219 -200.
[11]王德文,王鐵兵.梯度PCR在基因擴(kuò)增中的應(yīng)用[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志,2008,8(11):2527-2529.
[12]徐曉可,吳清平.肉類中大腸桿菌 O157∶H7多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].微生物學(xué)通報(bào),2008,35(4):619-622.
[13]李盛豐,趙 姣.單增李斯特菌不同PCR快速檢測(cè)方法比較[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2008,24(8):1021-1023.