順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

周麗霞，楊 森，那文婷，陸 莉，王譯擘，吳 玨，張 巍 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.臨床醫(yī)學(xué)院，.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.生化教研室，吉林 吉林 303)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高。對(duì)于肝癌的治療手段主要有手術(shù)治療、放療和化療等，其中化療是綜合治療的主要手段之一，而腫瘤細(xì)胞增殖的研究是評(píng)價(jià)化療藥效的一個(gè)重要指標(biāo)［1-2］。順鉑(cisplatin，DDP)是一種用于化療的鉑制劑，并且在多種實(shí)體瘤的治療中顯示了確切的療效。臨床上順鉑的應(yīng)用已有很久的歷史，1969年Rosenberg首次報(bào)道了順鉑的抗癌效應(yīng)［3］，但是其單獨(dú)用藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究則不多見(jiàn)。因而本實(shí)驗(yàn)研究順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，從而為順鉑的抗肝癌作用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HepG2細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫教研室惠贈(zèng);順鉑購(gòu)自山東齊魯藥業(yè)公司;MODEL 550型酶標(biāo)儀(BIO-BAD公司);LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)用分析儀廠);H110D電子分析天平(美國(guó)Sartorius);倒置顯微鏡(上海醫(yī)用分析儀廠)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生小牛血清的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并拍照，適量時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 MTT比色法測(cè)CDDP的抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液密度為1×104個(gè)/mL，按100μL/每孔接種于96孔培養(yǎng)板。并用順鉑與完全培養(yǎng)液配制成5、10、15、20 μg/mL不同的濃度培養(yǎng)，設(shè)置不加藥的對(duì)照組和不加MTT的空白對(duì)照組，復(fù)孔數(shù)為3。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，給藥后培養(yǎng)24 h，期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT［4］37 ℃ 孵育 4 h，棄去上清后每孔加150 μL DMSO(二甲基亞砜)，在搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光度值并記錄結(jié)果。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 IC50［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)全部數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用t檢驗(yàn)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的形態(tài)觀察見(jiàn)圖1。在顯微鏡下可見(jiàn)未加順鉑細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，加順鉑后在顯微鏡下觀察細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)?xì)胞脫離，生長(zhǎng)狀態(tài)極差。

2.2 順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

不同濃度順鉑處理Hela細(xì)胞24h后采用MTT法測(cè)得各組吸光度，計(jì)算順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，結(jié)果表明肝癌細(xì)胞的抑制率對(duì)順鉑的濃度呈明顯劑量相關(guān)性，順鉑的濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL。以空白組做對(duì)照，測(cè)得各組OD值(見(jiàn)圖2)。從圖中可看出不同濃度順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，各組與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為8.97 μg/mL。

3 討論

順鉑為治療多種實(shí)體瘤的一線藥［6］，順鉑為無(wú)機(jī)水溶性鉑類(lèi)絡(luò)合物，分子結(jié)構(gòu)中鉑原子發(fā)揮重要作用，可與DNA分子中鳥(niǎo)嘌呤或嘧啶堿基結(jié)合，形成DNA鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)，影響DNA合成與復(fù)制，抑制癌細(xì)胞分裂。順鉑的多方面臨床作用與其具有強(qiáng)氧化性有關(guān)，DDP的強(qiáng)氧化性能夠有效阻斷細(xì)胞增殖的過(guò)程，抑制細(xì)胞分裂，同時(shí)能夠誘導(dǎo)原有腫瘤細(xì)胞多種凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)其最終走向死亡［7］。有研究表明，順鉑可以通過(guò)細(xì)胞特異性Caspases依賴(lài)的信號(hào)途徑誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮殺瘤效應(yīng)［8］。Caspases是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，許多調(diào)控細(xì)胞凋亡的因素都通過(guò)Caspases酶系起作用的。其中Caspase-3為凋亡的效應(yīng)因子，負(fù)責(zé)對(duì)凋亡途徑最后執(zhí)行階段的全部或部分關(guān)鍵性蛋白酶的剪切，被稱(chēng)為凋亡的“執(zhí)行者”［9-10］。

圖1 不同濃度的順鉑對(duì)Hepg2細(xì)胞形態(tài)的影響:A.對(duì)照組;B.5 μg/mL;C.10 μg/mL;D.15 μg/mL;E.20 μg/mL

圖2 不同濃度順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

腫瘤共同的生物學(xué)特征是失控性生長(zhǎng)，其主要分子機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增生過(guò)多和凋亡減少，因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一［11］。因此本實(shí)驗(yàn)選用形態(tài)學(xué)觀察及MTT法對(duì)其抗增殖及誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行初步的測(cè)定，測(cè)定出順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞最佳的作用劑量。在顯微鏡下可見(jiàn)未加順鉑時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，加順鉑后細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，生長(zhǎng)狀態(tài)差，在顯微鏡下細(xì)胞皺縮，且具有劑量依賴(lài)性。本研究結(jié)果顯示:順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有抑制增殖作用，但其在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，凋亡相關(guān)基因的變化及凋亡信號(hào)的產(chǎn)生還有待深入研究，以進(jìn)一步闡述順鉑的作用機(jī)理。

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