肺炎克雷伯菌的多藥外排泵KetM的解析

高桂鳳，李英民，孫佳巖，張曉燕

(1．吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林吉林 132101;2．吉林省通榆縣扶貧開發(fā)辦公室，吉林通榆 137200;3．吉林省通榆縣職教集團，吉林通榆 137200)

肺炎克雷伯菌屬于腸道細菌科的革蘭氏陰性桿菌，人一旦被該菌感染易患大葉性肺炎，肺膿腫等病癥，且容易重度化［1］。

近年來，由于臨床上抗生素的大量使用，尤其是不合理使用，使肺炎克雷伯菌對抗菌藥獲得了耐藥性。該菌主要耐藥機理報道比較多的是含有超廣譜 β 內(nèi)酰胺酶(ESBL)的 β － 內(nèi)酰胺酶［2－3］。但近年來，不僅分離出對一種藥物產(chǎn)生耐藥性的菌株，還分離出對喹喏啉藥、氯霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素等結(jié)構(gòu)和作用機理不同的藥物產(chǎn)生耐藥性的菌株［4－5］。其中，對人類威脅最大的是對多種藥物產(chǎn)生耐藥性的菌株，由這種細菌引起的耐藥性被認為與抗菌藥向細胞外能動地排出機制密切相關(guān)。據(jù)報道對多種藥物產(chǎn)生耐藥性起關(guān)鍵作用的是多藥外排泵［6］。

一般地，多藥外排泵使細菌細胞對各種各樣的抗菌物質(zhì)、膽汁酸、重金屬離子產(chǎn)生耐藥性［7－8］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和能量作用的不同，多藥外排泵被分為MFS(主要易化超)家族、RND(耐藥結(jié)節(jié)分化)家族、SMR(ATP結(jié)合盒)家族、ABC(細小多藥耐藥)家族、MATE(多藥和有毒化合物的排出)家族五個家族。目前，在肺炎克雷伯菌中已報道的多藥外排泵僅有屬于RND家族 的AcrAB［9］、屬于SMR家族的 QacE［10］、屬于 MFS 家族的 KmrA［11］。

肺炎克雷伯菌的臨床分離株MGH78578是對多種抗菌藥產(chǎn)生耐藥性的菌株［12］。為了闡明其耐藥基因的遺傳學(xué)和生物化學(xué)特性，首先從該菌的染色體組上，克隆了對抗菌藥產(chǎn)生耐藥性的基因，并制成多個重組質(zhì)粒［12］。然后從中選擇一個重組質(zhì)粒，并對其上載有的耐藥性基因進行解析。

1 材料與方法

1．1 菌株與菌株制備 實驗菌株肺炎克雷伯菌MGH78578株和缺失大腸桿菌KAM32、載體pBluescript II來自日本岡山大學(xué)藥學(xué)部分子微生物教研室。首先，從肺炎克雷伯菌MGH78578菌株提取染色體DNA，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切，分離含有4～10 kb的DNA酶切片段;同時，載體pBluescript II用限制性內(nèi)切酶Bam H I酶切，并且使酶切面脫磷酸化，然后在連接酶的作用下將DNA片段插入到載體上得到重組質(zhì)粒pDSH8，這個質(zhì)粒含有一個插入基因命名為ketM。以缺失大腸桿菌KAM32(抗菌藥高度敏感性菌株;ΔacrB、ΔydhE、hsd)作為宿主，通過轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入宿主中得到 E．coli KAM32/pDSH8。

1．2 菌株和菌株培養(yǎng)條件 菌株E．coli KAM32/pDSH8用LB液體培養(yǎng)基(1%蛋白胨、0．5%酵母粉、0．5%NaCl，pH 7．0)在溫度37 ℃好氣條件下振動培養(yǎng)。另外，還使用在液體培養(yǎng)基里加2%瓊脂的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時，在液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基里添加終濃度為100μg/mL氨芐青霉素。

1．3 MIC(最小抑菌濃度)的測定 微型培養(yǎng)皿使用96孔U字型微型測試皿。首先，菌種在水解酪蛋白培養(yǎng)基里培養(yǎng)到OD650值為0．7～0．8左右，細菌濃度為4．8 ×109～1．03×1010左右，因為菌種處于對數(shù)期時，活力最強。然后，用無菌生理鹽水(NaCl 0．85%)進行1000倍稀釋作為接種用的菌液。再用這種稀釋菌夜5μL接種到100μL含各種濃度抗菌藥的MH培養(yǎng)基，在37℃靜止培養(yǎng)20 h后，用肉眼確認菌不能生長發(fā)育的最低濃度。

1．4 DAPI(4＇，6 － 二脒基 －2 － 苯基吲哚)排出活性的測定 DAPI一但插入到DNA上，熒光強度就增大，利用這個原理測定細胞內(nèi)DAPI蓄積量。在含有終濃度為100μL/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基使菌液培養(yǎng)到對數(shù)期的中期(OD650=0．7)，收集 E．coli KAM32/pDSH8 菌體(8000 r/min，5 min，4℃)，用tanaka最小鹽培養(yǎng)基(34 mmol/L KH2PO4、64 mmol/L K2HPO4、20 mol/L(NH4)2SO4、0．3 mmol/L MgSO4、1 mmol/L FeSO4、1 mmol/L ZnCl2、10 mmol/L CaCl2(pH 7．0))［13］洗 凈。用 含 5 μmol/L DAPI 和5 mmol/L DNP的相同培養(yǎng)基懸浮到 OD650值約0．1，并在 37 ℃ 振動10 h，然后集菌(8000 r/min，15 min，4 ℃)，用含有0．3 mmol/LMgSO4的嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)洗凈，再用MOPS懸浮，使OD650達到0．4左右。用熒光分光光度計在激發(fā)波長332 nm，發(fā)射波長463 nm測定熒光強度。

1．5 RT－PCR 從培養(yǎng)、收集 E．coli KAM32/pDSH8的細胞里提取RNA，RNA用QIAGENRNeasyMini kit(QIAGEN Inc)精制。經(jīng)過DNase處理的RNA最后收集到離心管1 ng，用 QIAGEN One－Step RT－PCR Kit(QIAGEN Inc)進行 RT－PCR。按添加的程序準備原料，并設(shè)計了Ket、uncB特異性的引物。引物的堿基順序:Ket的上游引物是5－CTGGCTATACCCGTCATCCTTG－3，下游引物是5－ATGTATCCGGCGTTCCACA－3;uncB的上游引物是5－ATTGCTCTGCTGCGCC－3，下游引物是5－GTCCTCAGGTCAGTGGCATTA－3。反應(yīng)結(jié)束后，進行3%瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收目的DNA片段。

1．6 同源性(進化過程中源于同一祖先的分支之間的關(guān)系)檢索 為了調(diào)查KetM和已知蛋白質(zhì)序列的類似性，選用了以下幾種已知蛋白質(zhì)，如大腸桿菌的YdhE、副溶血性弧菌的NorM、霍亂弧菌的VcmA、流感嗜血桿菌的 HmrM、鮑曼不動桿菌的AbeM、霍亂弧菌的 VcmD、VcmB、VcmM，用 BLAST進行同源性檢索。

1．7 MATE型多藥外排泵的系統(tǒng)樹的制作 為了進一步調(diào)查KetM與其它已知蛋白質(zhì)的親緣關(guān)系，選用了以下幾種蛋白，有大腸桿菌的YdhE、副溶血性弧菌的NorM、霍亂弧菌的VcmA、流感嗜血桿菌的HmrM、鮑曼不動桿菌的 AbeM、霍亂弧菌的VcmD、VcmB、VcrM、肺炎鏈球菌的 DinF等通過用Stanford university的計算機系統(tǒng)的ClustalW，Decypher制作了KetM的系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果

2．1 同源性檢索結(jié)果 肺炎克雷伯菌的KetM與MATE型多藥外排泵大腸桿菌的YdhE和副溶血性弧菌的NorM有很高的蛋白質(zhì)序列的相似性，KetM與MATE型多藥外排泵大腸桿菌的YdhE表示有56%的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的同一性和96%的蛋白質(zhì)序列的相似性(表1);與副溶血性弧菌的NorM表示有56%的同一性和96%的相似性。與霍亂弧菌的VcmA表示有54%的同一性和86%的相似性。從這些結(jié)果可以得知，肺炎克雷伯菌KetM屬于MATE型多種藥物外排泵。

表1 與KetM有相似性的多種藥物外排泵

2．2 MATE型多種藥物外排泵的系統(tǒng)樹的解析據(jù)報道MATE家族成員分為3個集團［13］。根據(jù)系統(tǒng)樹認為KetM與副溶血性弧菌的NorM和大腸桿菌的YdhE屬同一集團(圖1)

圖1 MATE型多種藥物外排泵的系統(tǒng)樹

2．3 大腸桿菌KAM32/pDSH8對抗菌藥敏感性的變化 通過測定MIC調(diào)查KetM對耐菌性的影響，結(jié)果見表2。大腸桿菌KAM32/pDSH8與對照組大腸桿菌KAM32/pBluescriptII比較，諾氟沙星的MIC升高8倍，吖啶黃、赫希斯特33342、頭孢噻肟的MIC上升了2倍，DAPI的MIC上升了64倍。由此可見，含有基因ketM的大腸桿菌 KAM32/pDSH8對多數(shù)抗菌藥產(chǎn)生耐藥性。

2．4 DAPI排出活性的測定 KetM被認為屬于MATE家族的外排泵。據(jù)報道這個家族的外排泵是利用位于細胞膜的 Na+作為運輸基質(zhì)動力［14－17］，如副溶血性弧菌的 NorM［17］和 VmrA［15］，大腸桿菌的 YdhE［18］以及霍亂弧菌非醇的 VcmA［14］和VcrM［16］等。另一方面，還有試驗數(shù)據(jù)表明鮑曼不動桿菌的AbeM是利用H+作為運輸基質(zhì)動力。在這里，為了調(diào)查KetM是否利用Na+作為排出抗菌藥的動力，測定了DAPI排出活性(圖2)。結(jié)果顯示，與對照組比較含有 ketM的大腸桿菌KAM32/pDSH8菌株利用陽離子排出DAPI的能力明顯增強。添加能量源乳酸－TMAH(呼吸鏈的基質(zhì))DAPI向細胞外排出，而添加 KCl、NaCl、LiCl的過程，更加促進了DAPI的排出活性。特別是通過添加KCl顯著地引起了DAPI排出(圖3)。添加KCl、NaCl、LiCl，但未添加乳酸 － TMAH，即使只添加NaCl、LiCl也可增強DAPI的排出活性(圖4)。但是只添加KCl時，未見DAPI的排出。因此，認為在乳酸－TMAH和KCl都存在時，KetM擁有最大的排出活性。從以上結(jié)果顯示，KetM擁有依靠能量排出DAPI的活性。實際上，從以上試驗確認了KetM是外排泵。

表2 大腸桿菌KAM32/pDSH8的各種抗菌藥的最小抑菌濃度(MIC)

圖4 其他鹽離子對DAPI排出的影響

2．5 RT－PCR 從上述的調(diào)查了解到KetM是屬于MATE家族的多種藥物外排泵，并且耐藥性也特別強，因此，它的基因表達水平也應(yīng)該很好。為了調(diào)查ketM在肺炎克雷伯菌MGH78578內(nèi)表達狀況，用uncB作為內(nèi)參基因，用 RT－PCR調(diào)查了ketM的mRNA的表達水平(圖5)。結(jié)果ketM與內(nèi)參基因uncB一樣表達良好。

圖5 ketM在肺炎克雷伯菌的表達

3 討論

本實驗從遺傳學(xué)及生物化學(xué)上對多種藥物外排基因ketM進行了研究。通過同源性檢索和系統(tǒng)樹分析發(fā)現(xiàn)KetM是屬于MATE型的泵。通過測定MIC和抗菌藥排出活性發(fā)現(xiàn)KetM是多藥外排泵。用RT－PCR法證明了基因ketM不但耐藥性強而且基因的表達水平也很強。

從以上結(jié)論得知，大腸桿菌KAM32/pDSH8與對照組大腸桿菌KAM32/pBluescriptII相比耐藥性更強。因此，這兩種菌株在生物制藥研究上可作為供試菌株。MIC測試結(jié)果則提供了很好的抑菌參數(shù)，所以，本研究為生物制藥提供了前期的準備工作，具有重要參考價值。

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