北沙參對(duì)小鼠免疫功能的影響研究

李建業(yè)，劉運(yùn)周，張 薇，王超要，胡衛(wèi)紅

（中國人民解放軍第四二一醫(yī)院 檢驗(yàn)輸血科，廣東 廣州510318）

北沙參為常用中藥，2010版《中華人民共和國藥典》收載為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr．Schmidt ex Miq．的干燥根［1］，其化學(xué)成分豐富，類型復(fù)雜，具有鎮(zhèn)咳祛痰、抗菌、抗癌和滋陰補(bǔ)虛等藥理作用［2］。目前對(duì)北沙參的相關(guān)研究主要集中在栽培種植技術(shù)和化學(xué)成分鑒定分離分析等方面［3－4］，但對(duì)北沙參化學(xué)成分的藥理活性及兩者之間的關(guān)聯(lián)方面缺乏深入的研究，因此，我們通過對(duì)北沙參進(jìn)行深入的化學(xué)成分及藥理活性研究，希望能尋找其具有相關(guān)療效的有效成分，從而使北沙參更好地發(fā)揮其藥用價(jià)值。

1 材料和方法

1．1 材料

動(dòng)物：Balb／c小鼠，18－22g，雌雄各半，均由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。藥品及器材：細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青公司；CCK－8試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所，CK04；不銹鋼細(xì)胞篩、手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗等手術(shù)器械（均需經(jīng)消毒處理）購自晶普醫(yī)療器械有限公司；注射器、燒杯、PBS（自配，高壓蒸汽滅菌后使用）和環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)008526）；北沙參（自制成不同濃度，至4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組及給藥 取50只Balb／c小鼠隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組（生理鹽水）、陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺）、北沙參1g·kg－1組、北沙參2．0g·kg－1組和北沙參4．0g·kg－1組，每組10只動(dòng)物。北沙參各劑量組每天0．2ml灌胃給藥1次，連續(xù)給藥10d。陽性對(duì)照組以100mg·kg－1劑量給動(dòng)物腹腔注射環(huán)磷酰胺1次。

1．2．2 臟器指數(shù)的計(jì)算 分組及給藥見1．2．1。于末次給藥24h后，稱量各組小鼠體重，脫頸椎處死小鼠，迅速取出完整脾臟和胸腺，修去脂肪、系膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。胸腺（脾）指數(shù)＝胸腺（脾）重 （mg）／體重（g）。

1．2．3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備［5］頸椎脫臼法處死小鼠，70%乙醇浸泡5min；預(yù)冷PBS注射，使注入的液體散布于整個(gè)腹腔；腹膜上剪開一小口，迅速用注射器通過開口插入腹腔內(nèi)吸出細(xì)胞懸液。

巨噬細(xì)胞的純化：細(xì)胞懸液離心10min后棄上清，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱中2h。取出培養(yǎng)瓶，除去未貼壁的細(xì)胞。瓶中已貼壁的細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后換液，得到接近純凈的巨噬細(xì)胞。

北沙參對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的測(cè)定：將從上述各組小鼠腹腔分離純化后的巨噬細(xì)胞置于CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄上清，每孔加入0．1%的中性紅溶液，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出，棄中性紅。PBS清洗96孔培養(yǎng)板3次，棄上清。加入細(xì)胞裂解液，靜置過夜，570nm波長下測(cè)定OD值（630nm為校正波長）。

1．2．4 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備［6］脾淋巴細(xì)胞的獲?。侯i椎脫臼法處死小鼠，70%乙醇浸泡5min，剪開小鼠胸腔，取出脾臟置于培養(yǎng)皿中，Hank’s液漂洗。粗剪脾臟成小塊，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上，輕輕擠壓，收集濾過的細(xì)胞懸液，加入消化緩存液除去血紅細(xì)胞。將上述收集到的脾臟細(xì)胞置于含培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h，除去貼壁細(xì)胞，收集未貼壁的細(xì)胞懸液即獲得接近純化的脾臟淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)接種培養(yǎng)。

北沙參對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞殺瘤活性的影響（CCK－8法）［7］：取事先配好的靶細(xì)胞懸液加入96孔板，于CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h。之后取1．2．1中不同處理組的小鼠脾淋巴細(xì)胞加入96孔板，按效靶比20∶1加入，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后加入10μl CCK－8溶液。培養(yǎng)4h，測(cè)定波長450nm，校正波長600nm，計(jì)算殺傷率，公式如下：

1．2．5 小鼠自然殺傷細(xì)胞的制備［8］小鼠脾臟NK細(xì)胞的獲得：頸椎脫臼法處死小鼠，70%乙醇浸濕小鼠全身。超凈工作臺(tái)內(nèi)取出脾臟置于不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，100目不銹鋼篩網(wǎng)上研磨至單個(gè)細(xì)胞，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后，離心5min。棄上清，加入消化緩存液以除去血紅細(xì)胞。加入0．4ml生理鹽水，離心5min，細(xì)胞沉淀重懸于培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度。取事先配好的靶細(xì)胞懸液加入96孔板，于CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)2h后加入NK細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)過夜。棄上清，輕洗每孔3次，加入0．1%的中性紅溶液，37℃，30 min。棄染液，輕洗每孔3次，加入細(xì)胞溶解液，492 nm測(cè)定吸光度值，公式如下：

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，t－test及三組以上（單因素 One－way）或者兩組之間（兩因素 Twoway）方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0．05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 北沙參對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

與正常對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟、胸腺重量顯著降低；與環(huán)磷酰胺 組相比，北沙參組小鼠胸腺、脾臟重量明顯高于環(huán)磷酰胺組，見表1。

表1 北沙參對(duì)小鼠免疫器官重量的影響（ˉx±s，n＝10）

2．2 北沙參對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

小鼠連續(xù)灌胃給予不同濃度的北沙參溶液，巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力見表2，在低、中、高劑量組北沙參可以增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力。

表2 北沙參對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響（ˉx±s，n＝10）

2．3 北沙參對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞抑瘤活性的影響

北沙參1g·kg－1、2g·kg－1和4g·kg－1對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的殺瘤率分別為20．76%、28．47%和36．61%，見表3。

表3 北沙參對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞殺瘤活性的影響（xˉ±s，n＝10）

2．4 北沙參對(duì)小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷能力的影響

北沙參1g·kg－1、2g·kg－1和4g·kg－1對(duì)小鼠自然殺傷細(xì)胞的殺傷率分別為20．58%、27．64%和38．37%，結(jié)果見表4。

表4 北沙參對(duì)小鼠脾臟自然殺傷（NK）細(xì)胞的影響（ˉx±s，n＝10）

3 討論

北沙參含有揮發(fā)油、香豆素、淀粉、生物堿、三萜酸、豆甾醇、各甾醇，沙參素等成分，可增強(qiáng)正氣，減少疾病，預(yù)防癌癥的產(chǎn)生［10］。

作為機(jī)體重要免疫器官的胸腺和脾臟，其臟器系數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)。單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中高度分化、成熟的細(xì)胞類型—巨噬細(xì)胞，其由血液中單核細(xì)胞遷入組織后分化而成，在固有免疫中發(fā)揮防御功能，也是參與適應(yīng)性免疫的專職抗原提呈細(xì)胞。單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一，當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可迅速被單核巨噬細(xì)胞吞噬和清除。本文采用體內(nèi)給藥，體外分離純化巨噬細(xì)胞，測(cè)定巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力。淋巴細(xì)胞由淋巴器官產(chǎn)生，是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分，成熟淋巴細(xì)胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發(fā)揮其免疫功能。自然殺傷細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，活化的自然殺傷細(xì)胞可合成和分泌多種細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫、造血和直接殺傷靶細(xì)胞等作用。

實(shí)驗(yàn)證明，北沙參組可以增加小鼠胸腺、脾臟重量，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，提高小鼠淋巴細(xì)胞的殺瘤率和自然殺傷細(xì)胞的殺傷能力。其相關(guān)具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（一部）［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010．92．

［2］成文娜，郭承軍，石俊英．北沙參近十年的研究進(jìn)展［J］．齊魯藥事，2008（27）：734．

［3］時(shí)新剛，李淑娥，孫慶雷，等．北沙參的1HNMR指紋圖譜研究［J］．山東科學(xué)，2009（22）：24．

［4］舒春清，郭 杰，石玉文，等．北沙參栽培技術(shù)與繁種方法［J］．實(shí)用技術(shù)，2005（12）：36．

［5］薛慶善．體外培養(yǎng)的原理和技術(shù)［M］．北京：科學(xué)出版社，2001．30－38．

［6］鄂 征．組織培養(yǎng)技術(shù)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1982．245－289．

［7］陳 奇．中藥藥理研究方法學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．748－752．

［8］陳 奇．中藥藥理研究方法學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．755－760．

［9］陳 奇．中藥藥理研究方法學(xué)［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006．749－754．

［10］辛 華，雨 龍．北沙參的生物學(xué)與化學(xué)成分的研究進(jìn)展［J］．中草藥，2008，（8）：1275．