嘌呤核苷酸對(duì)海洛因依賴及戒斷大鼠垂體嘌呤核苷酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

崔佳樂，洪新雨，趙麗艷，，劉劍凱，洪 敏＊

（1．吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 長春130021；

2．吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130021；3．吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130041；4．吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 長春130021）

毒品的濫用成癮是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題，海洛因是具有代表性的阿片類毒品，對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的器官都有較嚴(yán)重的毒性和潛在的危害［1，2］，神經(jīng)系統(tǒng)常受損嚴(yán)重。以往的研究表明海洛因可造成機(jī)體嘌呤核苷酸的分解代謝增強(qiáng)，表現(xiàn)為血尿酸明顯增高［3］，并且發(fā)現(xiàn)阿片類藥物使大鼠大部分組織器官中次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的基因表達(dá)下降，同時(shí)給予腺苷或嘌呤核苷酸則可逆轉(zhuǎn)或緩解阿片類物質(zhì)所致的某些損害［4－6］。有學(xué)者報(bào)道ATP和它的代謝產(chǎn)物通過激活腺苷和／或嘌呤受體而調(diào)節(jié)下丘腦功能，這些受體表達(dá)在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞，包括下丘腦神經(jīng)元，有分泌作用的垂體細(xì)胞和支持細(xì)胞［7］。這些都提示核苷酸的代謝情況會(huì)與海洛因成癮及戒斷情況下垂體的功能狀態(tài)密切相關(guān)。本文通過檢測(cè)海洛因成癮、戒斷及補(bǔ)償嘌呤核苷酸大鼠垂體嘌呤核苷酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)情況的變化，觀察海洛因?qū)︵堰屎塑账岽x的影響，及嘌呤核苷酸的治療干預(yù)作用，為探討補(bǔ)償嘌呤核苷酸作為海洛因戒癮的新療法及其將來應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物、藥品及試劑

實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠80只，體重為200±20g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：吉檢證字第2003－0001號(hào)）。海洛因（純度98%）由吉林省公安廳禁毒辦公室提供，臨用時(shí)用生理鹽水溶解、抽濾除菌。嘌呤核苷酸：腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP），鳥苷一磷酸（guanosine monophosphate，GMP）為 AMRESCO公司產(chǎn)品。PCR引物：特異引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，引物設(shè)計(jì)根據(jù)Primer 5．0設(shè)計(jì)軟件完成。β－肌動(dòng)蛋白Ⅰ（β－actinⅠ）擴(kuò)增產(chǎn)物長度為511bp，上游引物：5′－GAAATCGTGCGTGACATTAA－3′， 下 游 引 物：5′－CTAGAAGCATTTGCGGTGCA－3′；β－肌動(dòng)蛋白Ⅱ（β－actinⅡ）擴(kuò)增產(chǎn)物長度為218bp，上游引物：5′－AAGAGAGGCATCCTGACCCT－3′，下 游 引 物：5′－TACATGGCTGGGGTGTTGAA－3′；ADA 引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度 為 258bp，上 游 引 物：5′－GCAACATTATCGGCATGGAC－3′，下 游 引 物：5′－CAAGATCCACAACCTCATCAG－3′；HGPRT引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為410bp，上游引物：5′－GCTGACCTGCTGGATTACATTA－3′，下 游 引 物：5′－CCACTTTCGCTGATGACACAA－3′。

1．2 動(dòng)物分組與給藥

80只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成8組，每組10只，喂食普通固體飼料，自由飲水，同條件飼養(yǎng)，自然晝夜采光。①對(duì)照組（C）：第1－10天每日2次腹腔注射生理鹽水，注射體積及時(shí)間與當(dāng)日海洛因給藥體積及時(shí)間相同，第11天處死。②核苷酸組（N）：第1－10天每日2次（AM7：00和PM19：00）腹腔注射核苷酸（AMP與GMP等摩爾混合），每日次劑量均為7．5mg·kg－1體重，第11天處死。③海洛因組（H）：第1－10天每日2次（AM7：00和PM19：00）腹腔注射海洛因，每日次劑量依次為0．50、0．75、1．25、2．00、3．00、4．25、5．75、7．50、7．50和7．50mg·kg－1體重，第11天處死。④海洛因＋核苷酸組（NH）：第1－10天每日2次（AM7：00和PM19：00）腹腔注射核苷酸和海洛因（核苷酸劑量同當(dāng)日核苷酸組，海洛因劑量同當(dāng)日海洛因組），第11天處死。⑤海洛因戒斷3d組（W3）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－13天停藥，第14天處死。⑥海洛因戒斷9d組（W9）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－19天停藥，第20天處死。⑦核苷酸3d組（N3）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－13天每日2次腹腔注射核苷酸（給藥劑量及時(shí)間同核苷酸組），第14天處死。⑧核苷酸9d組（N9）：第1－10天每日2次腹腔注射海洛因（同海洛因組），第11－19天每日2次腹腔注射核苷酸（給藥劑量及時(shí)間同核苷酸組），第20天處死。

1．3 RT－PCR法檢測(cè)垂體組織的 ADA mRNA和HGPRT mRNA含量

異硫氰酸胍法提取大鼠垂體組織的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)在0．2ml Eppendorf管中建立反應(yīng)混合物包括：10×PCR Buffer 5μl，dNTP（10mmol·L－1）1μl，β－actin上下游引物各10pmol，ADA和HGPRT的PCR反應(yīng)上下游引物（ADA的PCR反應(yīng)上下游引物各50pmol，HGPRT的PCR反應(yīng)上下游引物各10pmol），cDNA 1 μl，Taq DNA聚合酶（5U·μl－1）0．5μl，加三蒸水補(bǔ)足體積至50μl。ADA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件：①95℃，3min；②95℃，35s；③64℃，1min；④72℃，1 min；⑤重復(fù)步驟②－④，34個(gè)循環(huán)；⑥72℃，10 min。HGPRT擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件：①95℃，3 min；②95℃，35sec；③58℃，1min；④72℃，1min；⑤重復(fù)步驟②－④，27個(gè)循環(huán)；⑥72℃，10min。RT－PCR產(chǎn)物的定量鑒定：PCR產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色后用Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳結(jié)果的拍照及電泳條帶的強(qiáng)度分析，分別計(jì)算每一條泳道的目地基因擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參β－actin擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度比值，表示該目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 8．0統(tǒng)計(jì)軟件，垂體組織的ADA mRNA及HGPRT mRNA含量以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠垂體組織中ADA基因表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，海洛因組、戒斷3d組大鼠垂體ADA mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值上有所增高，但各組均未見明顯差異（P＞0．05）。見圖1，表1。

2．2 各組大鼠垂體組織中HGPRT基因表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，核苷酸組HGPRT mRNA增多（P＜0．05），海洛因組未見到顯著改變（P＞0．05）。見圖1，表1。

圖1 各組大鼠垂體組織中ADA和HGPRT基因表達(dá)水平

表1 各組大鼠垂體組織中ADA和HGPRT基因表達(dá)水平（n＝3，x—±s，λB／U·L－1）

3 討論

嘌呤核苷酸（AMP和GMP）作為RNA／DNA的組成成分，是細(xì)胞內(nèi)非常重要的分子，同時(shí)在細(xì)胞間嘌呤核苷與核苷酸又是遞質(zhì)，通過嘌呤能受體引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，參與幾乎所有的生命活動(dòng)。腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）是降解嘌呤核苷酸的關(guān)鍵酶之一，催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷，進(jìn)而分解成次黃嘌呤。次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine－guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）是嘌呤核苷酸補(bǔ)救合成關(guān)鍵酶，由于在腦組織內(nèi)嘌呤核苷酸僅有補(bǔ)救合成途徑，因而HGPRT的作用很重要。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，海洛因組、海洛因戒斷3d組大鼠垂體ADA mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值上有所增高，海洛因戒斷9d組又下降，但各組均未見明顯差異（P＞0．05）。這種變化的趨勢(shì)與以往文獻(xiàn)中睪丸、附睪組織相似［8］，但不同在于幅度較小。同時(shí)，與對(duì)照組比較，核苷酸組、核苷酸3d組、及核苷酸9d組ADA mRNA相對(duì)表達(dá)量的數(shù)值相近，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）?？梢杂^察到海洛因成癮和戒斷時(shí)，同時(shí)給予嘌呤核苷酸能夠使ADA mRNA水平保持相對(duì)的穩(wěn)定。

同時(shí)，與對(duì)照組比較，除核苷酸組HGPRT mRNA增多（P＜0．05），其他各組未見到顯著改變（P＞0．05）。雖然相對(duì)于對(duì)照組，海洛因組 HGPRT mRNA水平較低，但海洛因戒斷3d組數(shù)值上升，說明可能對(duì)于不同的酶，海洛因作用的起效時(shí)間有所差異。且在海洛因戒斷的同時(shí)給予嘌呤核苷酸（即核苷酸3d組），HGPRT mRNA水平更加接近于對(duì)照組。這提示補(bǔ)償核苷酸組依然表現(xiàn)出“對(duì)抗”海洛因的作用。

以往的研究表明，海洛因給藥加強(qiáng)了多種組織內(nèi)嘌呤核苷酸的分解，并且降低了補(bǔ)救合成［3］，繼而導(dǎo)致了嘌呤核苷酸的代謝失衡。由于腦組織的特殊性，其內(nèi)部僅有嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成，而缺乏從頭合成，使得腦組織內(nèi)嘌呤核苷酸缺失。研究認(rèn)為補(bǔ)償嘌呤核苷酸恰恰可以抑制這種缺失情況，從而抵抗了海洛因依賴導(dǎo)致的各種毒副作用［4］。同時(shí)海洛因依賴會(huì)使包括垂體的多種組織內(nèi)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)造成損害［8］，而補(bǔ)償嘌呤核苷酸后可以緩解或抑制這種損害。海洛因成癮及戒斷的情況很復(fù)雜，同時(shí)補(bǔ)償嘌呤核苷酸是否可能從多個(gè)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)和作用，垂體內(nèi)嘌呤核苷酸的代謝情況及具體作用機(jī)制還有待于深入的研究。

［1］Goletiani NV，Mendelson JH，Sholar MB，et al．Opioid and cocaine combined effect on cocaine－induced changes in HPA and HPG axes hormones in men［J］．Pharmacol Biochem Behav，2009，91（4）：526．

［2］Graziani M，Antonilli L，Togna AR，et al．Non－opioid induction of morphine－6－glucuronide synthesis is elicited by prolonged exposure of rat hepatocytes to heroin［J］．Drug Alcohol Depend，2008，98（3）：179．

［3］Yang YD，Zhang JZ，Sun C，et al．Heroin affects purine nucleotides catabolism in rats in vivo［J］．Life Sci，2006，78（13）：1413．

［4］闞慕潔．嘌呤核苷酸補(bǔ)償對(duì)阿片類藥物與毒物作用的干預(yù)性研究［D］．長春：吉林大學(xué)，2008．

［5］何海濤，孫 婷，崔佳樂，等．嘌呤核苷酸補(bǔ)償對(duì)嗎啡依賴大鼠嘌呤核苷酸分解代謝的影響［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（8）：1081．

［6］崔佳樂，劉昕鳴，王 巍，等．嘌呤核苷酸對(duì)海洛因依賴及戒斷大鼠心肌酶學(xué)的影響［J］．吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，35（3）：474．

［7］Stojilkovic SS．Purinergic regulation of hypothalamopituitary functions．Trends Endocrinol Metab［J］．2009，20（9）：460．

［8］崔佳樂．海洛因及補(bǔ)償嘌呤核苷酸對(duì)雄性大鼠生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響［D］．長春：吉林大學(xué)，2008．