百合多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表征

吳 雄，何純蓮，陳 蓉

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410006）

百合是傳統(tǒng)藥食兼用佳品，具有多種藥理活性成分，其中多糖的含量高達(dá)6%[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明百合多糖具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2-6]。通過對百合多糖結(jié)構(gòu)分析，從構(gòu)效關(guān)系對百合多糖的藥理活性進(jìn)行系統(tǒng)研究，因此對百合多糖的純化及結(jié)構(gòu)表征具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對百合多糖的研究已逐步開展起來，提取方法和條件已較為成熟，但是對其化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究仍然比較少，大多數(shù)對百合多糖的研究報(bào)道缺乏詳盡的結(jié)構(gòu)信息。本文采用水提醇沉，Sevag試劑脫蛋白法[7]得到百合多糖粗品；采用DEAE-52纖維素柱層析[8-9]、Sephadex G-100凝膠層析[10]純化分離得到三種多糖，并應(yīng)用HPLC法[11]對其分子量進(jìn)行測定、應(yīng)用紅外光譜分析法[12]對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，旨在為百合多糖藥理活性的深入研究和功能性食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司，BlueStar）；高效液相色譜儀 （日本島津，LC-2010A HT）；蒸發(fā)光散射器（天津埃文森科技有限公司，ELSD800）；傅里葉紅外光譜儀（北京第二光學(xué)儀器廠，WQF-310）。 百合 （湖南省龍山縣提供）；DEAE-52 纖維素 （Whatman）；Sephadex G-100（Pharmacial）；甲醇（色譜純）；咔唑、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、無水乙醚、丙酮、氯仿、正丁醇、苯酚等均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑。

1.2 百合多糖的提取分離純化

1.2.1 百合多糖粗品提取工藝

新鮮百合→洗凈切碎、稱重→水提取→離心、過濾→4℃醇沉過夜→離心、過濾→復(fù)溶→Sevag法脫蛋白→ 醇沉、過濾→無水乙醇、無水乙醚、丙酮洗滌→烘干、得多糖粗品。

1.2.2 DEAE 52-纖維素柱層析

采用2.0×55cm層析柱，填料高度35cm，上樣濃度8mg/mL，用250mL去離子水、250mL0.04MNaCl溶液、300mL0.1MNaOH溶液依次進(jìn)行洗脫，10mL每管收集洗脫液。用苯酚-硫酸法在490nm下測定收集樣中的糖含量，作出洗脫曲線圖。根據(jù)洗脫曲線圖，將各洗脫峰樣品收集合并，經(jīng)濃縮、透析后，加乙醇至70%沉淀后過濾得到三種多糖，烘干備用。

1.2.3 百合多糖的Sephadex G-100柱層析純化

百合多糖I：采用2.0×55cm層析柱，填料高度36.5cm，流速 3min/ml，5ml每管收集；上樣百合多糖I，用0.1M NaCl溶液進(jìn)行洗脫。百合多糖II：采用1.0×58cm層析柱，填料高度33cm，流速2min/ml，3ml每管收集；上樣百合多糖 II，用 0.1M NaCl溶液進(jìn)行洗脫。百合多糖III：采用2.0×55cm層析柱，填料高度38cm，流速3min/ml，5ml每管收集；上樣百合多糖III；用0.1M NaCl溶液進(jìn)行洗脫。用苯酚-硫酸法在490nm下進(jìn)行檢測,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)作圖。

1.3 百合多糖理化性質(zhì)及紅外、紫外分析

1.3.1 理化性質(zhì)分析

溶解性：取少量多糖樣品于10mL的水、熱水、乙醇、丙酮等溶劑中，2h后觀察其溶解情況。

碘-碘化鉀反應(yīng)：于百合多糖溶液((1mg/mL)中加人碘-碘化鉀溶液，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照，淀粉溶液(1mg/mL)作陽性對照。

糖醛酸含量分析：采用咔唑-硫酸法測定多糖中糖醛酸含量。取8支具塞比色管，各加入12ml濃硫酸，置于冰水浴中，冷卻依次加入濃度為0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL 的半乳 糖醛 酸標(biāo)準(zhǔn) 溶液2mL，充分混合后，再置冰水浴中冷卻。然后在沸水浴中加熱10min冷卻到室溫，各加入0.15%咔唑無水乙醇溶液lmL，搖勻，在室溫下暗處放置2h，測定吸光度(A)，建立線性回歸方程，取樣品液1mL，用同樣的方法進(jìn)行測定，通過線性計(jì)算糖醛酸含量。

1.3.2 紅外分析

1.3.3 紫外分析

1.4 百合多糖分子量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）對百合多糖I、II、III進(jìn)行分子量的測定。 色譜柱為TSK gelG2000SWXL柱，以超純水為流動相，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量 10μL。

建立回歸方程：將系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品6000，11800，37500，112000，212000，402000 分 別配成濃度為0.2%的溶液，以1gMr(分子量對數(shù))對TR(保留時(shí)間)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，計(jì)算其分子量。

2 結(jié)果

圖1為百合多糖的DEAE52-纖維素柱洗脫曲線，用250mL去離子水洗脫得百合多糖I，后用250mL 0.04mol/L NaCl洗脫得百合多糖II，再用300mL 0.1mol/L NaOH洗脫得到百合多糖III。

2.1 百合多糖的分級純化

圖1 百合多糖的DEAE52-纖維素柱洗脫曲線

由圖 1 可知， 水、0.04mol/L NaCl、0.1 mol/L NaOH的洗脫曲線均為單一峰形，分別收集各洗脫峰主峰位置的洗脫液。重復(fù)上樣，將收集到的樣品濃縮、醇沉，獲得多糖樣品。

2.2 百合多糖的葡聚糖純化

下圖為經(jīng)葡聚糖柱洗脫后所得三種多糖的葡聚糖G-100洗脫曲線

圖2 百合多糖Ⅰ的葡聚糖G-100洗脫曲線

圖3 百合多糖Ⅱ的葡聚糖G-100洗脫曲線

圖4 百合多糖Ⅲ的葡聚糖G-100洗脫曲線

由圖2、3、4可知，三條洗脫曲線均為單一峰形，分別收集各洗脫峰主峰位置的洗脫液濃縮、醇沉得百合多糖純品。

2.3 理化性質(zhì)

百合多糖I為淺黃色晶體，硬度高，不易吸潮，不溶于冷水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，微溶于熱水。碘-碘化鉀測試成陰性，說明不含淀粉。由表1咔唑-硫酸法測定其糖醛酸含量為13.64%。

百合多糖II為淺黃色晶體，硬度略低于百合多糖I，不易吸潮，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，微溶于冷水，易溶于熱水。碘-碘化鉀測試成陰性，說明不含淀粉。由表1咔唑-硫酸法測定其糖醛酸含量為10.98%。

百合多糖III為淺黃色粉末，易吸潮，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，易溶于冷水，尤其易溶于熱水。碘-碘化鉀測試成陽性，說明含淀粉。由表1咔唑-硫酸法測定其糖醛酸含量為14.55%。

表1 百合多糖中糖醛酸含量

2.4 紅外光譜分析

圖6 百合多糖Ⅱ紅外圖譜

圖7 百合多糖Ⅲ紅外圖譜

從圖5可以看出百合多糖I在3456cm-1處為-OH伸縮振動的吸收峰；1651cm-1處為C=O非對稱伸縮振動吸收峰；1100-11200 cm-1處有三個(gè)峰，為吡喃糖的特征吸收峰，則1024cm-1處為吡喃糖環(huán)的醚鍵C-O-C和-OH的變角振動的吸收峰。在700-1000 cm-1的吸收峰則是α-和β-吡喃單糖形成的特征吸收峰，則810cm-1，876cm-1處均為甘露糖殘基吸收峰。

從圖6可以看出百合多糖II在3440cm-1處為-OH伸縮振動的吸收峰，1639cm-1處為C=O非對稱伸縮振動吸收峰，1100-1200 cm-1處只出現(xiàn)兩個(gè)峰，為呋喃糖苷的特征吸收，1153 cm-1，1024cm-1處為呋喃糖環(huán)的醚鍵C-O-C和-OH的變角振動的吸收峰。900-100cm-1處的小峰為=C-H面外彎曲振動峰，1400-1485cm-1處不明顯的峰為C-H面內(nèi)彎曲振動峰。

從圖7可以看出百合多糖III在3465cm-1處為-O-H伸縮振動的吸收峰，1454 cm-1處為C-H變角振動吸收峰，1685cm-1處為C=O伸縮振動吸收峰，是糖醛酸的特征吸收峰，也可能是有少量蛋白的殘留。1100-1200 cm-1處有明顯可見的三個(gè)峰，則1157 cm-1，1020cm-1處為吡喃糖環(huán)的醚鍵CO-C和-OH的變角振動的吸收峰，在700-1000 cm-1的吸收峰則是α-和β-吡喃單糖形成的特征吸收峰，862cm-1處的吸收峰是甘露糖殘基吸收峰。

2.5 紫外光譜分析

多糖在190nm-200nm有一溶劑峰，無核酸（260nm）、蛋白質(zhì)（280nm）特征峰，說明多糖中不含蛋白質(zhì)和核酸成分。

2.6 百合多糖相對分子量的測定

表2 不同分子量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間

圖8 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖9 百合多糖Ⅰ的液相圖譜

圖10 百合多糖Ⅱ的液相圖譜

圖11 百合多糖Ⅲ的液相圖譜

由圖9可知，百合多糖I有三個(gè)峰，且峰形有所重疊，說明多糖中由不同分子量的糖組成，且分子量比較接近而無法完全分開。三個(gè)峰的保留時(shí)間依次為 9.440，10.323，11.157，其中第 1、2 峰的峰面積較小，含量較低，故忽略不計(jì)。以11.157為該多糖的分子量計(jì)算，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中可得百合多糖I的分子量為97672。

由圖10可知，百合多糖II有五個(gè)主峰，峰面積相近，且峰形重疊，表明分子量范圍比較接近而無法完全分開，因此該多糖的分子量為一定范圍內(nèi)的數(shù)值。五個(gè)峰的保留時(shí)間依次為8.207，8.573，8.907，9.273，9.623，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算可得百合多糖II的分子量范圍為219927-465232。

由圖11可知，百合多糖III有二個(gè)峰，其保留時(shí)間依次為10.557，11.223，其中第1個(gè)峰的峰面積較小，故忽略不計(jì)。以11.223為該多糖的分子量計(jì)算，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中可得百合多糖III的分子量為94321。

3 討論

采用水提醇沉得到的粗多糖，經(jīng)DEAE 52-纖維素柱層析、Sephadex G-100凝膠柱層析分離純化得到三種多糖。對純化后的多糖進(jìn)行理化性質(zhì)的初步鑒定，發(fā)現(xiàn)百合多糖I為淺黃色晶體，不溶于冷水和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，微溶于熱水；不含淀粉；糖醛酸含量為13.64%；百合多糖II為淺黃色晶體，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，微溶于冷水，易溶于熱水；不含淀粉；其糖醛酸含量為10.98%；百合多糖III為淺黃色粉末，易吸潮，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，易溶于冷水和熱水；含淀粉；糖醛酸含量14.55%。

采用HPLC測量多糖分子量，顯示百合多糖I的平均分子量為97000，百合多糖II的平均分子量范圍220000-465000，百合多糖III的平均分子量94000。

紅外光譜表征顯示三種多糖都有-OH、C=O、C-O-C等多糖的特征吸收。

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