南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE－L硝酸還原酶基因的生物信息學(xué)分析

林敏卓，劉晨臨，黃曉航，楊平平

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061）

硝酸鹽是許多海區(qū)浮游植物中氮的主要來源，經(jīng)浮游植物吸收后，在體內(nèi)經(jīng)過一系列酶的還原作用，最終轉(zhuǎn)化成為氨氮后合成其他有機(jī)物質(zhì)［1－2］。存在于細(xì)胞質(zhì)的硝酸還原酶（NR）是氮素同化作用中的限速酶［3］，可直接調(diào)節(jié)硝酸鹽還原，從而調(diào)節(jié)氮代謝，處于植物氮代謝的關(guān)鍵位置，其活力的大小直接影響了硝酸鹽的生物利用度，在海洋生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程中占有極其重要的地位。

高等植物的NR是由相同亞基組成的二聚體，每個(gè)單體含有1條100kDa的多肽和3個(gè)輔助因子，即FAD，細(xì)胞色素和鉬輔因子（MoCo）。每個(gè)輔助因子相當(dāng)于1個(gè)氧化還原中心。NR分子中電子的傳遞途徑為：NAD（P）H＋H＋→FAD→細(xì)胞色素→MoCo→硝酸鹽［4］。

2000年Yamasaki等［5］首次證實(shí)，在pH7.0的離體條件下，玉米誘導(dǎo)型硝酸還原酶（inducible NR，iNR）具有以NADH作為電子供體，催化亞硝酸鹽的單電子還原合成一氧化氮（NO）的能力；Zhao等人［6］對(duì)擬南芥的NR野生型和缺陷性突變株研究表明，通過NR蛋白的積累，依賴于NR的NO合成對(duì)擬南芥的冷適應(yīng)有很重要的作用。

目前，有關(guān)NR的研究主要集中在近海有關(guān)的浮游植物方面，對(duì)極地多樣化的浮游植物群落的相關(guān)研究開展的還很少。南極地區(qū)具有獨(dú)特的地理及氣候特征，嚴(yán)酷的極地環(huán)境造就了生活在海冰環(huán)境中的真核光合微藻（冰藻）獨(dú)特的生物學(xué)特性。在南極海冰的形成、生長(zhǎng)和融化的季節(jié)性變化中，冰藻也經(jīng)受了溫度、光照等生態(tài)條件的劇烈變化。為數(shù)不多的研究報(bào)道表明，南極冰藻NR的結(jié)構(gòu)和酶活特征與常溫浮游植物的存在明顯差異：Rigano等［7］比較了溫度對(duì)南極嗜冷單細(xì)胞藻（KoliellaAntarctica）和常溫藻（Chlorellasorokiniana）的NR酶活的影響，發(fā)現(xiàn)嗜冷藻最適酶活溫度為15℃，在10℃時(shí)仍能保持77%的活性。

南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）是分離自南極海冰中的一種單細(xì)胞綠藻，對(duì)低溫、高鹽等逆境具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。衣藻生活的海冰鹽囊的鹽濃度可達(dá)海水鹽濃度的5倍，同時(shí)承受著低至－25℃的低溫脅迫［8］。通過室內(nèi)培養(yǎng)南極冰藻研究發(fā)現(xiàn)，其最適生長(zhǎng)溫度在4～10℃左右，最高生長(zhǎng)溫度不超過15℃，培養(yǎng)液置于－20℃冰箱保存，不影響其活力，在5倍正常海水鹽度的條件下（150‰），仍然能夠正常生長(zhǎng)，目前還沒有冰藻最低生長(zhǎng)溫度的報(bào)道。

本研究通過對(duì)克隆到南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR基因的序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，旨在通過與其它藻類進(jìn)行比較分析，為南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的抗凍機(jī)制和NR基因功能的研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）由中國(guó)極地研究所（上海）提供，在南極中山站（69°S，77°E）附近浮冰中分離得到。藻種接種于滅菌海水配置的Provasoli培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為7℃，1 300～1 600lx和12L／12D。

南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR基因序列來自于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）cDNA文庫，測(cè)序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司代為執(zhí)行。

1.2 NR基因的生物信息學(xué)分析

NR基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）分析通過 NCBI網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行操作，用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件預(yù)測(cè)蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)。通過SWISS－MODEL［9－11］（http：∥swissmodel.expasy.org／）網(wǎng)站預(yù)測(cè) NR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

將測(cè)定的NR序列用BLAST軟件與GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中已知的其他NR序列進(jìn)行比對(duì)。選取相似性較高的序列［12］用BioEdit軟件進(jìn)行對(duì)位排列，人工校正和合并序列。用MEGA 4.0［13］軟件分析中的緊鄰法（neighbor－joining method，NJ），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自展檢測(cè)法（bootstrap test）估計(jì)所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，重復(fù)次數(shù)為1 000次。運(yùn)用MegAlign軟件將ICE－L的NR基因和其它4個(gè)遺傳距離較近的綠藻NR基因進(jìn)行氨基酸序列同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NR基因的序列分析

測(cè)序分析表明，該基因全長(zhǎng)為3 053bp，含有1個(gè)完整的開放閱讀框，編碼863個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白的理論分子量為96.11kDa，等電點(diǎn)為6.42。

將預(yù)測(cè)的NR氨基酸序列進(jìn)行Protein Blast分析發(fā)現(xiàn)其含有與鉬輔因子、細(xì)胞色素b5和FAD功能域相似的序列（圖1）。

圖1 Blast分析NR基因可能含有的功能域Fig.1 The functional domains of NR gene predicted by Blast analysis

2.2 NR的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對(duì)南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）可以看出南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR基因與綠藻中的團(tuán)藻、萊茵衣藻，杜氏鹽藻和小球藻等綠藻的親緣關(guān)系最近，其次是硅藻中的三角褐指藻和海鏈藻，以及紅藻中的江蘺。

圖2 NR的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of NR genes

2.3 NR的氨基酸序列同源性分析

運(yùn)用MegAlign軟件將南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR氨基酸序列和4種綠藻的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)并研究了其活性位點(diǎn)（圖3，其中，黑體字表示各亞基的起始位點(diǎn)；普通字體加下劃線表示不同NR中起關(guān)鍵作用的保守氨基酸序列；黑體加下劃線表示不同NR中起關(guān)鍵作用的氨基酸序列中氨基酸殘基的差異），從分析結(jié)果可看出南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）與其他4種綠藻的各功能域的氨基酸序列之間還是有一些明顯的差異，南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）與團(tuán)藻、萊茵衣藻，杜氏鹽藻和小球藻的同源性依次分別為63%，61%，60%和54%。

圖3 南極衣藻（Chlamydomonas sp.ICE－L）NR和4種不同NR氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homological analysis of amino acid sequence carried out for ICE－L NR and other 4types of NRs

2.4 NR基因的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

將南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR氨基酸序列提交到SWISS－MODEL預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其存在3段不同的功能域序列（表1），其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖4所示，其中，A，B，C分別為不同肽段所對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)模型。

由表1可見，所預(yù)測(cè)的南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）的NR氨基酸序列含有的3段不同的功能域，與上述Blast分析的結(jié)果相一致。

表1 預(yù)測(cè)南極衣藻（Chlamydomonas sp.ICE－L）硝酸還原酶所含3個(gè)肽段的信息Table 1 Information about the predicted three peptides of the ICE－L nitrate reductase

圖4 預(yù)測(cè)南極衣藻（Chlamydomonas sp.ICE－L）硝酸還原酶所含三個(gè)肽段的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The predicted 3Dstructures of the ICE－?L nitrate reductase

3 討 論

對(duì)不同物種的研究發(fā)現(xiàn)，不同生物的硝酸還原酶的亞基組成和分子量變化很大［14］：小球藻（Chlorella vulgaris）的硝酸還原酶由4個(gè)分子質(zhì)量為90kDa的亞基組成，布朗纖維藻（Ankistrodesmusbraunii）則是由8個(gè)分子質(zhì)量為60kDa的亞基組成，鏈孢囊（Neurosporacrassa）和黏紅酵母（Rhodotorulaglutinis）均含有2個(gè)分子質(zhì)量分別是115kDa和118kDa的亞基，膝溝藻（Gonyaulax）的硝酸還原酶由6個(gè)分子質(zhì)量為52kDa的亞基組成。海洋硅藻中的硝酸還原酶在分子質(zhì)量上與高等植物相近，大約為95～120kDa。但是甲藻中硝酸還原酶的組成基團(tuán)的分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于該值，只有52kDa。通過核酸序列推斷南極冰藻的硝酸還原酶單一亞基的分子量為96kDa，與已報(bào)道的綠藻該酶的分子量相近。

多個(gè)物種的NR氨基酸序列比對(duì)分析表明，南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR和幾種綠藻NR的同源性比較高（平均為59.5%）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR與綠藻NR的進(jìn)化距離較近，與高等植物和真核菌NR的距離較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)分析顯示，南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR含有與高等植物NR相類似的3個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域，分別為：FAD，細(xì)胞色素和鉬輔因子。從這一結(jié)果來看，南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）NR與綠藻的NR相類似。

已有的一些研究表明，藻類的硝酸還原酶特性會(huì)因藻種的不同而存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致了藻類對(duì)硝酸鹽利用效率的差異。南極冰藻NR具有有別于常溫藻活性特征。Gao等［16］發(fā)現(xiàn)南極海鏈藻（Thalassiosiraantarctica）和南極棕囊藻（PhaeocystisantarcticaVona）的NR酶活的最適溫度相比較于常溫藻的更低。Vona［15］和 Rigano等［7］通過對(duì)南極冰藻（Koliellaantarctica）和小球藻（Chlorellasorokiniana）的硝酸還原酶活性的比較研究發(fā)現(xiàn)，不同來源藻類的NR適應(yīng)的溫度范圍不同，冰藻K.antarctica的NR具有比C.sorokiniana的NR有更好的冷適應(yīng)性和低溫下更高的酶活特性。

南極衣藻對(duì)逆境所表現(xiàn)的強(qiáng)大的耐受力使其成為植物抗逆機(jī)制研究的理想材料，從南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）中克隆到的NR序列，是目前唯一一條有報(bào)道的南極冰藻NR基因序列。通過對(duì)南極衣藻南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）與其他物種的生物信息學(xué)的比較研究分析：一方面，可以為南極衣藻（Chlamydomonassp.ICE－L）中NR的功能和酶學(xué)的深入研究提供參考；另一方面，為南極衣藻在抗凍機(jī)制上的研究提供參考。

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