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    北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒

    2012-09-28 01:44:20吳青君徐寶云王少麗張友軍
    植物保護(hù) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:西花薊馬紙條

    李 飛, 吳青君, 徐寶云, 謝 文, 王少麗, 張友軍

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

    西花薊馬[Frankliniella occidentalis (Pergande)]是世界性的、園藝作物上最重要的害蟲之一[1],2003年在我國首次發(fā)現(xiàn)并迅速上升為保護(hù)地蔬菜和花卉上的主要害蟲之一[2]。西花薊馬除可以直接取食造成危害外,還能夠傳播多種植物病毒,西花薊馬是番茄斑點(diǎn)萎蔫病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)最有效的傳播媒介,其傳播病毒病造成的危害損失遠(yuǎn)大于其本身的危害。番茄斑萎病毒屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus),于1915年由Brittlebank首次在澳大

    利亞發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已在世界上多個(gè)國家和地區(qū)廣泛分布,侵染煙草、大豆、番茄、花生、辣椒、萵苣、菊花等作物及多種雜草等900多種植物,是全世界10種危害性最大的植物病毒之一[3],在我國被列為進(jìn)境植物檢疫的危險(xiǎn)性有害生物。雖然我國早在1984年就從花生上分離到 TSWV[4],在四川曬煙上也發(fā)現(xiàn)TSWV的危害[5],但其后的10多年來并未廣泛流行,因此未有進(jìn)一步的研究。近年來,在西花薊馬發(fā)生重災(zāi)區(qū)的云南,不斷在花卉和煙草上檢測(cè)到番茄斑萎病毒屬病毒,并呈迅速蔓延之勢(shì),對(duì)云南的煙草和花卉產(chǎn)業(yè)已構(gòu)成巨大威脅[6-7]。

    2012年5 月,筆者在田間調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)西花薊馬為害嚴(yán)重的辣椒上出現(xiàn)枯斑、黃色環(huán)狀紋等疑似番茄斑萎病毒病的癥狀,作者對(duì)海淀區(qū)疑似植物樣品和西花薊馬發(fā)生嚴(yán)重的昌平地區(qū)的植物樣品進(jìn)行了鑒定,并測(cè)定了植物上發(fā)生的西花薊馬是否攜帶番茄斑萎病毒。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    辣椒葉片采于海淀區(qū)的2個(gè)日光溫室和1個(gè)連棟玻璃溫室內(nèi),葉片表現(xiàn)褪綠環(huán)斑、壞死斑、同心環(huán)癥狀,采回實(shí)驗(yàn)室立即鑒定。茄子樣品采于昌平的日光溫室,葉片表現(xiàn)黃綠不均,成斑駁狀,上面有薊馬幼蟲及為害狀。分別從兩種作物上采集50頭左右薊馬,首先鑒定是否為西花薊馬,然后檢測(cè)是否帶毒。

    1.2 主要試劑

    Trizol總RNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;TaKaRa RT-PCR試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司;2×Taq 10Master Mix,北京奧賽博科技發(fā)展有限公司;蛋白酶K,天根生化科技(北京)有限公司;樹脂,Sigma公司;TSWV快速檢測(cè)試紙條,安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司。

    1.3 薊馬種類的鑒定

    薊馬基因組DNA的提取參照White等的方法并稍加改進(jìn)[8]。將單頭西花薊馬置于滴有3μL蛋白酶K parafilm膜上,以200μL PCR管底部作為勻漿器充分研磨,勻漿液移入200μL PCR管,然后加入20μL的樹脂,混勻之后置于37℃恒溫水浴1 h,每隔15min振蕩1次,然后金屬浴96℃10min,于-20℃保存?zhèn)溆谩N骰ㄋE馬的鑒定參照孟祥欽SCAR分子檢測(cè)技術(shù)[9],上游引物堿基序列為:5′-GAAACTACTATTGTTTGTGAGCTG-3′,下游引物 堿 基 序 列 為:5′-AAGAAACTAAC-GTGAAGGATACTC-3′。

    1.4 TSWV快速試紙條檢測(cè)

    取一片3cm×4cm帶有疑似癥狀的葉片,將葉片放入提取液瓶中,蓋緊蓋子用力搖動(dòng)20s,直到液體變?yōu)榘稻G色。然后用滴管將液體滴2滴到試紙條的點(diǎn)樣孔中,大約30s后可以看到試紙條的窗口區(qū)變?yōu)樗{(lán)色,等到對(duì)照C線顯現(xiàn)后,即可查看結(jié)果。如果T線顯現(xiàn),說明該樣品為陽性,T線的顏色比較深說明帶毒量比較高,顏色淺說明帶毒量少,如果沒有T線,說明該樣品為陰性。

    1.5 RT-PCR檢測(cè)

    參考天根的Trizol總RNA提取試劑盒說明書提取葉片及西花薊馬的總RNA,樣品于-80℃保存?zhèn)溆?。然后按照TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成,-20℃保存樣品。采用Vaira等[10]設(shè)計(jì)的引物:NF302:5′-GGGTCAGGCTTGTTGAGGAAAC-3′ 和 NR575:5′-TTCCCTAAGGCTTCCCTGGTG-3′。PCR 反應(yīng)體系為 20μL:cDNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2×Taq10Master Mix 10μL、ddH2O 7μL,PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性2min;40個(gè)循環(huán):94℃30s、60℃30s、72℃30s;最后72℃延伸5min[11]。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1.5%凝膠電泳檢測(cè),預(yù)測(cè)條帶為273bp。

    將PCR產(chǎn)物交由北京六合華大基因科技股份有限公司(BGI)測(cè)序,將獲得的序列通過BLAST進(jìn)行比對(duì)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 薊馬種類的鑒定

    以薊馬的DNA為模板,以2條SCAR引物:FOMF/FOMR分別進(jìn)行擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,能擴(kuò)增出一條西花薊馬特有的條帶,得到320bp左右的目的片段(圖1),表明上述植物上發(fā)生的薊馬種類為西花薊馬。

    圖1 薊馬種類鑒定結(jié)果電泳圖

    2.2 TSWV試紙條檢測(cè)結(jié)果

    用滴管將葉片提取液滴2滴到試紙條的點(diǎn)樣孔中,約30s后可以看到試紙條的窗口區(qū)變?yōu)樗{(lán)色,大約2min后對(duì)照C線顯現(xiàn),具有褪綠環(huán)斑的葉片均顯示T線(圖2a),表明該葉片均帶有番茄斑萎病毒。而癥狀輕的葉片,T線不明顯(圖2b),需進(jìn)一步驗(yàn)證。

    2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

    采用引物NF302/NR575對(duì)番茄斑萎病毒屬病毒N基因序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,表現(xiàn)褪綠環(huán)紋癥狀的辣椒葉片樣品、癥狀不明顯的辣椒和茄子樣品以及同時(shí)采集的西花薊馬均可獲得273bp左右的目的條帶(圖3、圖4),與預(yù)期結(jié)果一致,表明采集的辣椒、茄子樣品可能被番茄斑萎病毒侵染,西花薊馬可能攜帶番茄斑萎病毒。

    圖2 TSWV試紙條檢測(cè)

    2.4 獲得目的片段的序列比對(duì)

    將測(cè)得的目的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定,通過BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的273bp與番茄斑萎病毒屬病毒的N基因序列有98%的相似性,進(jìn)一步證明上述植物樣品的確受番茄斑萎病毒屬病毒侵染,而且薊馬體內(nèi)也攜帶番茄斑萎病毒屬病毒。

    3 討論

    通過采用番茄斑萎病毒的快速試紙條檢測(cè),以及進(jìn)一步的RT-PCR和序列測(cè)定證實(shí),在北京局部地區(qū)的辣椒和茄子上已發(fā)生番茄斑萎病毒病,這兩種作物上同時(shí)發(fā)生的薊馬種類主要為西花薊馬,并且攜帶該病毒。由薊馬傳播的番茄斑萎病毒位列世界10大重要病毒病的第2位[3],曾對(duì)西班牙東南部的溫室番茄、辣椒和花卉造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)到50%[12],在美國夏威夷、巴西、意大利和南非,番茄斑萎病毒病在20世紀(jì)80-90年代的某些年份流行導(dǎo)致番茄、萵苣等作物近乎絕產(chǎn)[13]。眾所周知,西花薊馬目前已遍布我國北京、云南、山東、貴州、新疆等地[14],對(duì)各地的蔬菜和花卉作物造成嚴(yán)重危害。世界各國的事實(shí)表明,伴隨西花薊馬在世界范圍內(nèi)的廣泛傳播與擴(kuò)散,常導(dǎo)致番茄斑萎病毒病的發(fā)生與流行。如果由西花薊馬傳播的番茄斑萎病毒病大面積發(fā)生,加上種苗調(diào)運(yùn)的遠(yuǎn)距離傳播,將對(duì)我國農(nóng)作物特別是經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的蔬菜和花卉作物生產(chǎn)造成毀滅性的災(zāi)害。為此,建議有關(guān)部門立即采取相應(yīng)的預(yù)防與管理措施,首先查明番茄斑萎病毒病在我國的分布現(xiàn)狀,同時(shí)開展相應(yīng)的控制技術(shù)研究,防止其擴(kuò)散蔓延。

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