鉛對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響與突觸囊泡蛋白相關(guān)

趙 奇，王 艷，武紅娟，陳 于

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室 400016）

鉛是廣泛存在于生產(chǎn)及生活環(huán)境中的重金屬元素，長期接觸鉛能夠造成機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)損傷，其中鉛對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用越來越被人們重視。有研究表明，長期接觸鉛可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)毒作用，造成神經(jīng)行為障礙和認(rèn)知能力低下等［1－2］。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是作為檢測實(shí)驗(yàn)大、小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能常用方法［3］，海馬腦區(qū)則是空間學(xué)習(xí)記憶功能的中樞［4］。突觸囊泡蛋白（Synaptophysin，Syn）是突觸囊泡的一種特異性標(biāo)志蛋白，與胞吐作用密切相關(guān)［5］。Syn變化可間接反映體內(nèi)突觸的數(shù)量和分布情況，與突觸重建及認(rèn)知過程密切相關(guān)，其缺乏可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降［6］。Syn在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮重要作用，并且其與鉛所致學(xué)習(xí)記憶功能損傷的關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)海馬區(qū)Syn表達(dá)與鉛所致小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷關(guān)系進(jìn)行研究，進(jìn)而探討鉛的神經(jīng)毒性作用相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)8～9周齡雄性昆明小鼠24只［（購自大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SCXK（渝）2007－0005］。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度：（21±2）℃，室內(nèi)光照12h（光照時(shí)間08：00到20：00），動(dòng)物進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料，自由進(jìn)水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和鉛染毒組，每組12只。

1.2 主要試劑及儀器 醋酸鉛（Sigma，美國）純度99.99%，突觸囊泡蛋白單克隆抗體（AB8049，Abcam，美國），驢抗小鼠熒光抗體IRDye800CW（LI－COR，美國），β－actin抗體（Sigma，美國）。MT－200型Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)（成都泰盟，中國），蛋白電泳系統(tǒng)（Bio－Rad，美國），Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（LI－COR，美國），DM6000B型倒置光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（Leica，德國）。

1.3 鉛染毒實(shí)驗(yàn) 鉛染毒組小鼠飼養(yǎng)飲水由醋酸鉛溶于蒸餾水中配制，醋酸鉛濃度2.4mmol／L，劑量參照文獻(xiàn)［7－9］，并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定；對(duì)照組飲水則為蒸餾水。飼養(yǎng)過程中，籠具、飲水瓶等所有用具均使用不含鉛的制品。各組動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，喂養(yǎng)30d后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行各項(xiàng)測試。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行：水池直徑120cm，池深50cm；平臺(tái)直徑10cm，位于水面下1cm。水池平分為四個(gè)象限，平臺(tái)位于其中一象限正中位置，實(shí)驗(yàn)開始后平臺(tái)位置固定不變，攝像頭位于迷宮正中上方位置。迷宮內(nèi)水溫保持在（23±2）℃，池水加奶粉使之渾濁。水迷宮實(shí)驗(yàn)正式開始前24h，各組小鼠均放入迷宮內(nèi)（無平臺(tái)）自由游10次，每次60s，使之適應(yīng)迷宮內(nèi)環(huán)境。在鉛暴露第30天，對(duì)照組和鉛染毒組進(jìn)行水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠面朝水迷宮池壁，隨機(jī)從四個(gè)象限中的一個(gè)象限中點(diǎn)輕輕放入水迷宮。每次訓(xùn)練設(shè)定時(shí)限60s，若60s內(nèi)小鼠找到隱藏在水面下的平臺(tái)，則讓小鼠在平臺(tái)上停留30s，并記錄其找到隱藏平臺(tái)的時(shí)間，即逃逸潛伏期；若60s內(nèi)小鼠未能找到平臺(tái)，則將小鼠輕輕引導(dǎo)至平臺(tái)上，并使之在平臺(tái)上停留30s，逃逸潛伏期記為60s。同時(shí)系統(tǒng)會(huì)記錄小鼠搜索平臺(tái)的軌跡。一次訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠擦干后，放在取暖器旁休息，等待下一次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練間隔15min，每只小鼠共訓(xùn)練8次。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，每組隨機(jī)取9只小鼠用水合氯醛麻醉，斷頭處死，取其海馬組織，組織凍存于－80℃?zhèn)溆?；另?只小鼠則用于做腦組織切片。

1.5 海馬區(qū)HE切片實(shí)驗(yàn) 將水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的兩組中的小鼠各3只，參照文獻(xiàn)［11］方法，取小鼠全腦做連續(xù)冠狀切片，常規(guī)HE染色后顯微鏡下觀察小鼠鉛染毒后海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)神經(jīng)元變化。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將凍存的組織加RIPA勻漿裂解后，提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，上樣量60μg，10%SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至NC膜，5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉。突觸囊泡蛋白單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜，驢抗小鼠熒光二抗（1∶5 000）室溫孵育1h，洗膜，Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描條帶，用Odyssey系統(tǒng)軟件對(duì)目的條帶熒光光密度進(jìn)行分析。β－actin做內(nèi)參，兩組結(jié)果再行比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組小鼠每次水迷宮逃逸潛伏期和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) （1）各組小鼠連續(xù)8次水迷宮實(shí)驗(yàn)逃逸潛伏期結(jié)果見表1。結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，其逃逸潛伏期逐漸縮短，即搜索到隱藏平臺(tái)所用時(shí)間逐漸減少。鉛染毒組小鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損，表現(xiàn)為第3次（P＜0.05）、第4次至第8次（P＜0.01）水迷宮實(shí)驗(yàn)，鉛染毒組小鼠逃逸潛伏期與對(duì)照組比較顯著延長（P＜0.05）。（2）軌跡圖（圖1）為第8次訓(xùn)練各組小鼠水迷宮軌跡。從軌跡圖上看，對(duì)照組小鼠經(jīng)過連續(xù)8次訓(xùn)練后，找尋平臺(tái)的方向性明確，路徑簡單直接；鉛染毒組小鼠搜索平臺(tái)的軌跡與對(duì)照組比，目標(biāo)性不明確，軌跡雜亂，經(jīng)過訓(xùn)練雖然能夠找到隱藏的平臺(tái)，但其找尋平臺(tái)的路徑相對(duì)方向性不如對(duì)照組準(zhǔn)確，無法快速有效搜尋到隱藏的平臺(tái)。

表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

訓(xùn)練次數(shù)逃逸潛伏期（s）對(duì)照組 鉛染毒組第1次60.00±0.00 60.00±0.00第2次 47.92±11.27 55.67±5.92第3次 46.59±14.79 51.09±11.45＊第4次 35.72±13.21 56.34±5.15＃

續(xù)表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

續(xù)表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

＃：P＜0.01，＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較。

訓(xùn)練次數(shù)逃逸潛伏期（s）對(duì)照組 鉛染毒組第5次 27.48±13.70 49.15±13.31＃第6次 32.70±10.80 44.33±12.62＃第7次 25.31±10.84 42.31±8.44＃第8次 26.09±8.56 37.44±11.62＃

2.2 Western blot檢測結(jié)果 與對(duì)照組比較，鉛染毒組小鼠海馬區(qū)中Syn表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖1 經(jīng)過連續(xù)8次訓(xùn)練后各組小鼠水迷宮軌跡圖

2.3 海馬區(qū)神經(jīng)元HE切片形態(tài)觀察 結(jié)果顯示，鉛染毒組小鼠海馬區(qū)較對(duì)照組無明顯變化。對(duì)照組和鉛染毒組海馬神經(jīng)元呈帶狀分布，排列整齊，CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞及齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞形態(tài)均正常，核居中，大而圓，染為淡藍(lán)色，核仁核膜清晰，核仁染為紫色，胞質(zhì)紅色且著色均勻，見圖3。

圖2 Western blot檢測Syn結(jié)果

圖3 兩組小鼠海馬區(qū)HE切片結(jié)果（×50）

3 討 論

現(xiàn)有研究認(rèn)為鉛直接的神經(jīng)毒性主要是促進(jìn)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)興奮性中毒及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)儲(chǔ)存與釋放的影響［12－13］。而本研究結(jié)果提示Syn在鉛導(dǎo)致的神經(jīng)毒性機(jī)制中可能亦發(fā)揮重要作用。

本研究中，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鉛染毒組小鼠逃逸潛伏期較對(duì)照組顯著延長，表明慢性鉛暴露可導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷。由于海馬是空間學(xué)習(xí)記憶重要腦區(qū)，其功能受到抑制時(shí)將會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降［14］。

有文獻(xiàn)指出，大鼠長期飲用高鉛水，鉛可通過血―腦屏障對(duì)大鼠大腦皮層和海馬組織造成明顯病理損傷，本實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)鉛對(duì)小鼠海馬造成明顯病理損傷［15］，但 Morris水迷宮卻顯示鉛已經(jīng)導(dǎo)致了小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷，提示鉛導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能損傷可能并非是單純由其導(dǎo)致的病理變化引起。

Syn與突觸囊泡的胞吐作用密切相關(guān)，其變化可間接反映體內(nèi)突觸的數(shù)量和分布情況，與認(rèn)知過程及突觸重建密切相關(guān)，Syn的缺乏可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降［6］。Western blot結(jié)果顯示，鉛染毒組小鼠海馬中Syn表達(dá)較對(duì)照組顯著降低。結(jié)合水迷宮實(shí)驗(yàn)和海馬HE切片結(jié)果，提示鉛染毒造成的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷，在其出現(xiàn)病理損傷前可能是由于鉛導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)Syn表達(dá)水平降低造成。但是鉛如何通過影響Syn表達(dá)進(jìn)而引起鉛染毒小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷，仍需要進(jìn)一步研究。

［1］ 楊坦，丁玉琴，劉萍.鉛暴露對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬CA1區(qū) LTP的影響［J］.醫(yī)學(xué)信息，2008，21（6）：872－875.

［2］ Chang W，Chen J，Wei QY，et al.Effects of Brn－3aprotein and RNA expression in rat brain following low－level lead exposure during development on spatial learning and memory［J］.Toxicol Lett，2006，164（1）：63－70.

［3］ 曲巍，王孝文，王金平.鼠腦穹窿海馬傘切斷突觸素動(dòng)態(tài)變化及Morris水迷宮重復(fù)訓(xùn)練對(duì)其影響［J］.解剖學(xué)研究，2009，31（6）：414－419.

［4］ 田楓，齊曉旭，鄭振輝.α－亞麻酸對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬神經(jīng)元的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29（6）：664－666.

［5］ Arthur CP，Stowell MH.Structure of synaptophysin：a hexameric MARVEL－domain channel protein［J］.Structure，2007，15（6）：707－714.

［6］ Schmitt U，Tanimoto N，Seeliger M，et al.Detection of be－h(huán)avioral alterations and learning deficits in mice lacking synaptophysin［J］.Neuroscience，2009，162（2）：234－243.

［7］ 高雙，宮慧芝，姜泓，等.PKC－γ和ERK在慢性染鉛小鼠腦皮質(zhì)區(qū)的異常表達(dá)［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，37（5）：627－640.

［8］ 彭博，吳哲，張朝東.鉛對(duì)小鼠大腦皮層神經(jīng)元磷脂酰肌醇3激酶影響［J］.中國公共衛(wèi)生，2010，26（2）：228－229.

［9］ 郝鳳進(jìn)，高雙，袁瑩，等.慢性鉛暴露對(duì)小鼠腦皮質(zhì)區(qū)ERK蛋白表達(dá)的影響［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，33（1）：16－18.

［10］Morris R.Developments of a water－maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.Neurosci Methods，1984，11（1）：47－60.

［11］劉劍，秦大蓮，黃新武，等.腦舒膠囊對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶力的改善及海馬神經(jīng)元的保護(hù)［J］.中藥藥理與臨床，2010，26（4）：54－57.

［12］Lidsky TI，Schneider JS.Lead neurotoxicity in children：basic mechanisms and clinical correlates［J］.Brain，2003，126（1）：5－19.

［13］Verina T，Rohde CA，Guilarte TR.Environmental lead exposure during early life alters granule cell neurogenesis and morphology in the hippocampus of young adult rats［J］.Neuroscience，2007，145（3）：1037－1047.

［14］許志強(qiáng)，張濤，張猛，等.proBDNF對(duì)老齡鼠空間學(xué)習(xí)與記憶功能的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2008，37（7）：683－685.

［15］蔣軍軍，賈慶華，劉春杰，等.醋酸鉛對(duì)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡作用［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2010，36（4）：224－229.