31例B型血友病患者凝血因子Ⅸ基因突變研究

劉丹娟，李莉艷，李 強(qiáng)，孫 競(jìng)，鐘 梅，羅深秋△

（南方醫(yī)科大學(xué)：1.細(xì)胞生物學(xué)教研室／骨與軟骨再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.南方醫(yī)院婦產(chǎn)科；3.南方醫(yī)院檢驗(yàn)科；4.南方醫(yī)院血液科，廣州 510515）

血友病是一組X連鎖隱性遺傳的出血性疾病，臨床上常見的有A型血友病（HA）和B型血友?。℉B）兩型，分別是由于凝血因子（F）Ⅷ和FⅨ基因突變所引起。在男性血友病患者中，HA占80%～85%，而HB僅占15%～20%，在男性中的發(fā)病率大約為1／30 000［1］，女性患者罕見。HB基因突變具有明顯的異質(zhì)性，可發(fā)生在FⅨ基因外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子及其側(cè)翼序列的任何位置［2］。目前已知的FⅨ基因突變類型包括點(diǎn)突變、缺失、插入等。

本研究利用PCR法及DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)31例HB患者進(jìn)行FⅨ基因突變檢測(cè)，對(duì)于明確FⅨ基因突變機(jī)制有重要意義，且豐富了FⅨ基因突變譜。

1 資料與方法

1.1 一般資料 31例HB患者均來自本院血液科及婦產(chǎn)科門診，F(xiàn)Ⅸ活性測(cè)定均小于5%。

1.2 研究方法 采集HB患者外周血2mL，以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用外周血DNA提取試劑盒（美國Life公司）提取DNA。根據(jù)FⅨ基因序列（Gene Bank K02402），參照文獻(xiàn)［3］設(shè)計(jì)并合成8對(duì)擴(kuò)增引物（表1），引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為50μL，加入上游和下游引物各5pmol（終濃度為0.1μmol／L），4種dNTP各5nmol（終濃度為0.1 mmol／L），5μL 10×Taq PCR Buffer（100mmol／L Tris－HCl，15mmol／L MgCl2和 500mmol／L KCl，pH 8.3），2U Taq DNA聚合酶（TAKARA公司），基因組DNA 50～200ng。PCR反應(yīng)在美國PE公司的9700型熱循環(huán)儀上進(jìn)行。測(cè)序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

表1 引物序列

續(xù)表1 引物序列

2 結(jié) 果

31例HB患者通過DNA測(cè)序均檢測(cè)到了突變位點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)Ⅸ基因的突變位點(diǎn)分散無熱點(diǎn)區(qū)，突變類型也不同。本研究中共發(fā)現(xiàn)了34種突變，其中1例為三重突變，6例為雙重突變，此外還發(fā)現(xiàn)13種新突變。31例HB患者均發(fā)現(xiàn)基因突變，其基因突變發(fā)生的堿基改變、具體部位（基因堿基序列編號(hào)采用Yoshitake方法［4］）、引起的氨基酸變化和是否為CpG突變熱點(diǎn)見表2。

表2 31例HB患者FⅨ基因突變

續(xù)表2 31例HB患者FⅨ基因突變

3 討 論

FⅨ基因定位于Xq27.1，基因全長約33.5kb，由8個(gè)外顯子、7個(gè)內(nèi)含子及其側(cè)翼序列中的調(diào)控區(qū)所組成［5］，mRNA全長2 804bp。FⅨ基因任意位置的缺陷引起蛋白結(jié)構(gòu)功能和數(shù)量的改變，均可導(dǎo)致HB的發(fā)生。

HB基因突變類型種類繁多，以點(diǎn)突變、短片段的缺失（少于30bp）和插入突變多見，其中80%左右為單個(gè)堿基的突變［6］。不同于 HA，HB的散發(fā)率可達(dá)30%～50%［7］。1990年Brownlee首次建立了HB突變數(shù)據(jù)庫。隨著病例數(shù)目的積累，新的缺陷正不斷地被發(fā)現(xiàn)。從已報(bào)道的突變分布看，包括polyA信號(hào)在內(nèi)的FⅨ基因所有區(qū)域均有突變發(fā)生。本研究除外6例缺失（一例全基因缺失和5例短片段缺失），其余均為點(diǎn)突變，占80.6%。由于編碼與Ca2＋結(jié)合的EGF區(qū)及催化區(qū)，外顯子4和8的突變發(fā)生率較高［8］。本研究中的31例患者，有11例發(fā)生于外顯子4和8，占35.5%。而外顯子1、6、7中突變較少，共占19.4%。

CpG雙核苷酸區(qū)域被認(rèn)為是突變熱點(diǎn)［9－10］，劉敬忠等［11］采用PCR法和GAWTS技術(shù)也進(jìn)一步證實(shí)了CpG確系突變熱點(diǎn)，主要是（C→T／A）。研究中有7例發(fā)生在CpG熱點(diǎn)上，類型為（C→T），（G→A）和（G→T），占22.6%。

Toyozumi等［12］確定了內(nèi)含子1的第192核苷酸（FⅨ192）為二核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，存在于健康日本人中。王寧遂等［13］發(fā)現(xiàn)并計(jì)算出中國人FⅨ－192A和G的基因頻率分別為0.81和0.19。本研究中有4例患者的突變發(fā)生于此處，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因此位置的多態(tài)性。2例患者只檢測(cè)出此惟一多態(tài)性位點(diǎn)需進(jìn)一步檢測(cè)未測(cè)序列，以確定致病突變位點(diǎn)。

經(jīng)過最新的血友病B數(shù)據(jù)庫資料查詢，本研究共發(fā)現(xiàn)13種新突變，為國際上首次報(bào)道。其中4種為發(fā)生在外顯子的錯(cuò)義突變，氨基酸改變分別為L－Q、Y－D、S－P和 V－G。除了－T為已報(bào)道的導(dǎo)致閱讀框架移位的突變點(diǎn)外，其余3種均為新發(fā)現(xiàn)的缺失突變類型，其中－GCTGAAACCA和－GCTAAACA引起閱讀框架移位，根據(jù)剪切位點(diǎn)的位置判斷［14］，－ATTT為剪接位 點(diǎn) 缺 失。此 外，T6320A、C6828T、G6640A、A29753G、G30321T和T17517G等6種突變發(fā)生于內(nèi)含子部位，已知6320為剪切位點(diǎn)，可確定T6320A為致病突變，其余5種突變是否為一種新的多態(tài)性或者為致病突變，則需要進(jìn)一步研究。

本文報(bào)道了31例HB患者FⅨ基因突變的研究，對(duì)臨床進(jìn)行HB攜帶者篩查及產(chǎn)前基因診斷具有重要的參考和指導(dǎo)意義。而FⅨ基因新突變的發(fā)現(xiàn)，在豐富HB基因突變譜的同時(shí)，還有助于進(jìn)一步了解FⅨ基因中某些氨基酸殘基對(duì)于FⅨ凝血活性的重要性，為明確HB的分子致病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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