鎂鋅合金促成骨細胞增殖作用及其相關(guān)機制研究＊

劉 波，潘 琦，王希明，田啟俊，周華江，潘 鋒

（1.山東省濟南市第四人民醫(yī)院骨三科 250031；2.中國醫(yī)科大學(xué)生物材料研究室，遼寧沈陽110001）

鎂鋅合金促成骨細胞增殖作用及其相關(guān)機制研究＊

劉 波1，潘 琦1，王希明1，田啟俊1，周華江1，潘 鋒2

（1.山東省濟南市第四人民醫(yī)院骨三科 250031；2.中國醫(yī)科大學(xué)生物材料研究室，遼寧沈陽110001）

目的觀察鎂鋅合金（Mg－Zn）共同培養(yǎng)對成骨細胞MC3T3－E1的促增殖作用及相關(guān)的作用機制。方法實驗分為對照組、Mg－Zn組、聚L－丙交酯（PLLA）組。采用細胞毒實驗（MTT）法檢測細胞增殖活性，酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法檢測整合素β2的表達變化，免疫印跡法（Western blotting）檢測細胞BMP－2和p－Smad1蛋白的表達變化。結(jié)果培養(yǎng)到第2天，3組間細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第4、6、8、10天時，Mg－Zn組 MC3T3－E1細胞增殖顯著高于對照組和PLLA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與PLLA組細胞增殖活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3組 MC3T3－E1細胞整合素β2的表達在第2、4、6天逐漸升高，第8天又逐漸減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在同一時間點Mg－Zn組整合素β2的表達顯著高于對照組和PLLA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），對照組和PLLA組之間整合素β2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論Mg－Zn共培養(yǎng)可以促進成骨細胞的增殖，上調(diào)整合素β2的表達和激活BMP／Smad信號通路能是其主要的作用機制。

整合素類；Smad蛋白質(zhì)類；鎂鋅合金；骨修復(fù)；骨形成蛋白；Smad蛋白

生物可降解的鎂鋅合金（Mg－Zn）具有好的機械學(xué)特性和生物相容性，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用研究，例如心血管的可降解支架、骨的固定材料等［1－2］。近期的研究顯示，Mg－Zn材料不僅有良好的生物相容性，還可以促進成骨和化股過程，其相關(guān)的作用機制研究極少［3］，因此，本研究將 Mg－Zn材料與成骨細胞混合培養(yǎng)，觀察Mg－Zn對成骨細胞的促生長作用，并探討其相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 成骨細胞MC3T3－E1在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)于低糖DMEM培養(yǎng)液中（10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100IU／mL），并分為對照組、Mg－Zn組、聚 L－丙交酯（PLLA）組。青霉素、鏈霉素購于美國Sigma公司，胎牛血清購于美國Gibco公司公司，DMEM培養(yǎng)基為廣州英韋創(chuàng)津公司產(chǎn)品，生物可降解Mg－Zn為上海奧芮濟醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品，聚L－丙交酯（PLLA）由長春圣博瑪生物材料有限公司提供，人β2整合素酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自上海希美生物科技有限公司，BMP－2、p－Smad1、GAPDH 抗體購自美國Santa Cruz公司，HRP標記二抗購自上?？党缮锛夹g(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖實驗 MC3T3－E1細胞接種到96孔板（400／孔），3組分別于培養(yǎng)2、4、6、8、10d時，加入0.5mg／mL二甲基四氮唑藍（MTT），檢測細胞的增殖活性，以酶標儀570nm波長處測定的吸光度（A）值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.2.2 整合素β2的檢測 MC3T3－E1細胞接種到6孔板（1×105／孔），3組分別于培養(yǎng)2、4、6、8、10d時取培養(yǎng)液上清液，嚴格按著整合素β2ELISA試劑盒說明操作，酶標儀450nm波長處測定測定各孔的A值，以A值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，然后對照標準曲線計算出整合素β2的濃度。

1.2.3 目的蛋白的免疫印跡法（Western blotting）檢測MC3T3－E1細胞接種到6孔板（5×105／孔），48h后，3組分別采用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞2次，1×SDS上樣緩沖液裂解細胞，95℃加熱10min，12 000×g離心10min，取上清液，8%～12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液（TBST）浸潤PVDF膜1h封閉非特異性結(jié)合，加入特異性的一抗（1∶1 000）4℃過夜，加入1∶5 000稀釋的二抗室溫1h，化學(xué)發(fā)光，X線曝光。掃描曝光膠片，Bio Rad凝膠成像儀分析軟件測定各蛋白條帶密度值，目的蛋白與內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的比值為蛋白表達相對定量值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩樣本比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Mg－Zn對 MC3T3－E1細胞增殖活性的影響 3組對MC3T3－E1細胞的增殖活性顯示，在第2天時，3組間細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），到第4、6、8、10天時，Mg－Zn組細胞增殖顯著高于對照組和PLLA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對照組和PLLA組細胞增殖活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明 Mg－Zn可以促進 MC3T3－E1細胞的增殖，見圖1。

圖1 3組成骨細胞MC3T3－E1的增殖活性

表1 3組MC3T3－E1細胞整合素β2表達（±s，μmol／L）

表1 3組MC3T3－E1細胞整合素β2表達（±s，μmol／L）

＊：P＜0.01，與對照組和PLLA組比較。

組別 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天對照組 0.31±0.06 0.85±0.26 0.91±0.28 0.65±0.18 0.53±0.09 PLLA 組 0.37±0.05 0.94±0.21 1.04±0.33 0.71±0.15 0.61±0.10 Mg－Zn組 0.64±0.13＊1.67±0.34＊1.62±0.41＊1.21±0.17＊1.08±0.16＊

2.2 Mg－Zn對 MC3T3－E1細胞整合素β2表達的影響 3組MC3T3－E1細胞整合素β2的表達在第2、4、6天逐漸升高，第8天又逐漸減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在同一時間點Mg－Zn組MC3T3－E1細胞整合素β2的表達水平高于對照組和PLLA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），對照組與PLLA組之間整合素β2的表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Mg－Zn對 MC3T3－E1細胞BMP－2和p－Smad1表達的影響

與對照組比較 Mg－Zn組顯著升高了 MC3T3－E1細胞BMP－2的表達，隨后Smad1蛋白的磷酸水平也相應(yīng)地出現(xiàn)了升高，而PLLA并沒有顯現(xiàn)出激活BMP／Smad通路的活性，見圖2。

3 討 論

近年來生物可降解的骨內(nèi)固定材料在骨科中的應(yīng)用已成為研究的熱點，生物可降解的Mg－Zn內(nèi)固定材料因其強度和塑韌性均強于可降解的陶瓷或聚合物材料，故而受到更多學(xué)者的關(guān)注［4－5］。鎂和鋅是體內(nèi)含量豐富的不可缺少的重要金屬元素，對機體多個系統(tǒng)的生長發(fā)育具有重要的影響，因此，Mg－Zn內(nèi)固定材料不僅不會釋放有毒離子，而且其釋放的鎂、鋅金屬離子反而會促進成骨細胞的增殖和分化［6－8］。本研究顯示，Mg－Zn與成骨細胞 MC3T3－E1共培養(yǎng)可以促進細胞的增殖，而另外一個生物可降解吸收骨內(nèi)固定材料PLLA沒有發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象，說明Mg－Zn可以促進骨折的愈合。

整合素是細胞黏附的一個重要調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)著細胞的增殖和分化。本研究顯示，與PLLA組相比Mg－Zn組可以促進成骨細胞MC3T3－E1高表達整合素β2蛋白，Mg－Zn組表面比PLLA組粗糙，而粗糙的表面也是刺激整合素表達的一個因素，但其具體的機制還有待進一步的研究［9－11］。骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）能誘導(dǎo)成骨細胞和軟骨細胞的分化成熟，在骨的修復(fù)中起到重要作用，BMPs的缺失會導(dǎo)致骨折的不愈合和骨缺損，BMPs通過磷酸化Smad蛋白，使p－Smad蛋白入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，激活下游靶基因的表達調(diào)控骨和軟骨的生成［12］。本研究顯示，Mg－Zn共同培養(yǎng)可以上調(diào) MC3T3－E1細胞BMP－2和p－Smad蛋白的表達，說明Mg－Zn共同培養(yǎng)可以激活BMP／Smad信號通路。

綜上所述，Mg－Zn共同培養(yǎng)可以促進成骨細胞的增殖，其作用機制可能與上調(diào)整合素β2的表達和激活BMP／Smad信號通路相關(guān)。

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The study on effect of magnesium zinc alloy on the proliferation of osteoblasts＊

Liu Bo1，Pan Qi1，Wang Ximing1，Tian Qijun1，Zhou Huajiang1，Pan Feng2
（1.Third Department of Orthopedic，the Fourth People′s Hospital of Jinan City，Shandong250031，China；2.Department of Biological Materials，China Medical University，Shenyang，Liaoning110001，China）

ObjectiveTo observe the effect of magnesium zinc（Mg－Zn）alloy on the proliferation of MC3T3－E1osteoblasts，and to study its action mechanisms.MethodsThe treatment was divided into three group：control group，Mg－Zn alloy group，PLLA group.The activity of cells proliferation was measured by MTT analysis.The protein level of integrinβ1was determined by ELISA assay.Western blot was used to detect the protein expression of BMP－2and p－Smad1，respectively.ResultsThere were no significant difference among 3groups in the second day（P＞0.05）；in the fourth，sixth，eighth and tenth day，the proliferation of MC3T3－E1cells in Mg－Zn alloy group was significantly higher than that in control group and PLLA group（P＜0.05）；there were no statistics significance of the proliferation in control group and PLLA group（P＞0.05）；the expression of cell integrinβ2in 3groups increased gradually in the second，fourth and sixth day and decreased gradually in the eighth day and showed statistic significance（P＜0.05）；at the same point of time，the expression of cell integrinβ2of Mg－Zn alloy were significantly higher than the that in control group and PLLA group（P＜0.01）；there were no statistic significance in the difference of the expression of cell integrinβ2between control group and PLLA group（P＞0.05）.ConclusionMg－Zn alloy significantly promoted the proliferation of osteoblasts.The upregulation of the expression of integrinβ2and in stimulation of BMP／Smad pathway are the main action mechanisms.

integrins；smad proteins；Mg－Zn alloy；bone repair；bone morphogenetic proteins

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.018

A

1671－8348（2012）35－3732－02

國家自然科學(xué)基金資助項目（81000791）。

2012－06－13

2012－09－12）

·基礎(chǔ)研究·