膽紅素對(duì)L－02細(xì)胞凋亡以及Bcl－2及Bax體外表達(dá)影響的研究

陳兆夷，陳兆武，王光明，鄧衍部，劉有理，黃志剛

（1.安徽省宣城市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 242000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230022）

膽紅素對(duì)L－02細(xì)胞凋亡以及Bcl－2及Bax體外表達(dá)影響的研究

陳兆夷1，陳兆武2，王光明1，鄧衍部1，劉有理1，黃志剛1

（1.安徽省宣城市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 242000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230022）

目的探討膽紅素對(duì)健康人肝細(xì)胞系L－02凋亡的影響及Bcl－2、Bax基因?qū)Φ蛲鲞^(guò)程的調(diào)節(jié)。方法將不同濃度的膽紅素（終濃度分別為0、100、150、200、250、300mg／L）作用于體外培養(yǎng)的健康人肝細(xì)胞L－02，采用流式細(xì)胞儀和碘化丙啶（PI）雙標(biāo)等技術(shù)觀察細(xì)胞的凋亡率和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)及凋亡相關(guān)基因Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果Bcl－2蛋白的表達(dá)，對(duì)照組為陰性表達(dá)，低濃度組弱陽(yáng)性表達(dá)，高濃度組強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Bax蛋白的表達(dá)，對(duì)照組可見(jiàn)表達(dá)，低濃度組表達(dá)增多，高濃度組明顯增多，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。表明Bcl－2蛋白表達(dá)越強(qiáng)，凋亡指數(shù)越少；Bax蛋白表達(dá)越強(qiáng)，凋亡指數(shù)越強(qiáng)。結(jié)論Bcl－2、Bax蛋白均參與了膽紅素所誘導(dǎo)的L－02細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，并在細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

膽紅素；細(xì)胞凋亡；L－02細(xì)胞系；Bcl－2；Bax

筆者在前期研究中證明，高膽紅素作用可導(dǎo)致L－02細(xì)胞先發(fā)生凋亡，隨后部分凋亡細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死，其程度與膽紅素濃度呈顯著正相關(guān)［1］。關(guān)于膽紅素對(duì)L－02細(xì)胞凋亡的機(jī)制及Bcl－2與Bax表達(dá)在其過(guò)程中的意義，筆者進(jìn)行了后續(xù)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膽紅素、DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；小牛血清為杭州四季青生物制品有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器 采用倒置熒光顯微鏡（德國(guó)LEICA公司），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞檢測(cè)儀（美國(guó)BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液的配制［2］精確稱(chēng)取膽紅素20mg，溶于稀釋血清80mL（其中血清和生理鹽水的比例是1∶24），加4mL二甲亞砜（DMSO）和2mL碳酸鈉（Na2CO3）（0.1mol）制成濃度為200mg／L（342μmol／L）的膽紅素溶液。每次實(shí)驗(yàn)前膽紅素溶液均新鮮配制，所有實(shí)驗(yàn)步驟均在弱光下進(jìn)行，以防止膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)槠渫之悩?gòu)體。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 健康人肝細(xì)胞系L－02細(xì)胞購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)，L－02細(xì)胞接種于體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清、青鏈霉素各100U／mL和谷氨酰胺2mol／L的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、95%濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平均每2～3天換液、傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 應(yīng)用不同濃度膽紅素溶液作用12h后收集各組細(xì)胞（1×106／mL），0.25%胰酶37℃消化細(xì)胞，至縮呈圓形，收集細(xì)胞入離心管離心（1 000r／min，10min），棄上清液，冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，200μL結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞。加入10μL Annexin－V異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），4 ℃避光孵育 30 min。加入300μL結(jié)合緩沖液和5μL濃度為20μg／mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）輕輕混勻，立即上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)在安徽省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.4 膽紅素對(duì)人肝細(xì)胞L－02Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的影響將L－02細(xì)胞（1×106／mL）接種于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后應(yīng)用不同濃度膽紅素溶液作用24h（終濃度分別為0、100、150、200、250、300mg／L）；棄上清液后用PBS洗2次并用多聚賴(lài)氨酸固定玻片；每張片加1滴過(guò)氧化氫酶阻斷溶液（試劑A），室溫下孵育20min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗4min 3次。去除PBS，滴加動(dòng)物血清（試劑B）封閉，室溫下孵育20min，清除非特異性吸附，以降低非特異性背景著色。擦去多余血清，滴加一抗Bcl－2（工作液），室溫下孵育3～4h，PBS沖洗4min 3次。滴加生物素化二抗工作液（試劑C），室溫下孵育20min，PBS沖洗4min 3次。去除PBS，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白一過(guò)氧化酶（試劑D），室溫下孵育20 min，PBS沖洗4min 3次。去除PBS，滴加DAB顯色液染色3 min。水洗終止，蘇木素染色，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。脫水干燥，透明，封片，光鏡下觀察，照相。判斷標(biāo)準(zhǔn)：按染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強(qiáng)度需與背景色相對(duì)比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用PEMS3.1for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組方差齊，采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；各組方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)；判斷兩數(shù)值變量間有無(wú)直線(xiàn)相關(guān)關(guān)系，及其相關(guān)方向和程度，采用相關(guān)分析法檢驗(yàn)，結(jié)果用±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 膽紅素誘導(dǎo)L－02細(xì)胞凋亡率變化 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，凋亡的L－02細(xì)胞分布在左上區(qū)，而正常細(xì)胞為FITC和PI均低染，分布在流式細(xì)胞分析圖的左下區(qū)。早期凋亡細(xì)胞以Annexin V－FITC染色為主，在流式細(xì)胞分析圖的右下區(qū)，晚期凋亡細(xì)胞則Annexin V－FITC和PI雙染色，位于流式細(xì)胞分析圖的右上區(qū)。本研究結(jié)果表明，膽紅素能誘導(dǎo)L－02細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率與膽紅素濃度呈濃度－效應(yīng)關(guān)系（圖1）。相關(guān)分析表明，細(xì)胞壞死數(shù)量與膽紅素濃度之間無(wú)明顯相關(guān)（r＝0.515 6，P＝0.295 2），但細(xì)胞凋亡數(shù)量與膽紅素濃度之間呈顯著相關(guān)（r＝0.885 2，P＝0.019 0）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度膽紅素作用L－02細(xì)胞12h后的凋亡的變化

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) Bcl－2、Bax蛋白的表達(dá) Bcl－2在300mg／L組偶見(jiàn)棕黃色顆粒狀，呈散在、弱陽(yáng)性表達(dá)，200mg／L組與300mg／L組相比較陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，染色加深，呈黃褐色表達(dá)，見(jiàn)封3圖2～4。

Bax主要在肝細(xì)胞胞漿呈棕黃色顆粒狀；0mg／L組未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，200mg／L組可見(jiàn)肝細(xì)胞散在、弱陽(yáng)性表達(dá)，較150 mg／L組有所增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，250mg／L組陽(yáng)性染色進(jìn)一步加深，陽(yáng)性細(xì)胞多，300mg／L組肝細(xì)胞彌漫陽(yáng)性染色，染色加深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，見(jiàn)封3圖5～7。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞有序而協(xié)調(diào)激活凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同控制的過(guò)程［3］。在線(xiàn)粒體調(diào)控細(xì)胞凋亡的體系中，Bcl－2、Bax是線(xiàn)粒體膜蛋白中最重要的代表。Bcl－2、Bax比例失調(diào)可能是肝細(xì)胞凋亡增加的原因之一［4］。Bcl－2基因是目前最受關(guān)注的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因之一。Bcl－2基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于線(xiàn)粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，任其氨基酸C－末端由19個(gè)氫基酸殘基組成的疏水性片段，并借此與膜相連。通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Bcl－2對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用［5］。目前，已發(fā)現(xiàn)多種與Bcl－2同源的基因，如Bclxl、Bcl－xs、Bax基因等［6］。這些基因構(gòu)成了Bcl基因家族，在體內(nèi)Bcl－2基因家族的成員可以具有兩種截然不同的功能，Bax基因是今年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡促進(jìn)基因，屬Bcl－2同一家族。Bcl－2保護(hù)線(xiàn)粒體的完整性，抑制細(xì)胞色素C的釋放，而B(niǎo)ax在線(xiàn)粒體膜上形成多聚體影響其完整性，使線(xiàn)粒體釋放Caspase活化因子（如細(xì)胞色素C等）并進(jìn)入胞漿中，誘發(fā)Caspase家族表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡［7］。Bax蛋白的氨基酸序列有21%與Bcl－2同源，有3種不同的編碼蛋白Bax－α、Bax－β及Bax－γ。Bax基因具有拮抗 Bcl－2抑制凋亡的作用。Bcl－2及Bax蛋白都是均一的二聚體，反應(yīng)時(shí)需一個(gè)分子Bcl－2及一個(gè)分子Bax結(jié)合，形成異二聚體，結(jié)合后的蛋白才具有調(diào)節(jié)功能［8］。Bax／Bcl－2的比值，對(duì)于決定細(xì)胞接受刺激信號(hào)后存活與否起關(guān)鍵作用。Bcl－2過(guò)量表達(dá)（Bcl－2－Bcl－2），細(xì)胞存活；Bax過(guò)量表達(dá)（Bax－Bax）細(xì)胞死亡。

本研究證實(shí)，在高濃度膽紅素時(shí)Bcl－2不表達(dá)或少量表達(dá)，肝組織出現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增加；在低濃度膽紅素時(shí)，Bcl－2大量表達(dá)，出現(xiàn)肝組織細(xì)胞凋亡明顯減少而表明，Bcl－2的表達(dá)起到了抑制肝細(xì)胞凋亡的作用。Bax明顯高表達(dá)時(shí)，體外膽紅素作用L－02細(xì)胞凋亡明顯增多，同時(shí)，Bcl－2蛋白表達(dá)越強(qiáng)，凋亡指數(shù)就越少；Bax蛋白越強(qiáng)，凋亡指數(shù)就越高。表明Bcl－2和Bax蛋白均參與了體外膽紅素作用于L－02細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，Bcl－2起抑制凋亡的作用，Bax起促進(jìn)凋亡的作用，他們?cè)诟吣懠t素時(shí)所致肝損害的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

本研究應(yīng)用凋亡定性（DNA片段、Hoechst33258熒光染色）分析獲取凋亡的直接證據(jù)和定量（流式細(xì)胞儀）對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行觀察；也分別從凋亡的早期（PI－Annexin V雙染色法）和晚期（DNA片段）檢測(cè)；免疫組化法進(jìn)一步檢測(cè)膽紅素處理肝細(xì)胞24h后Bcl－2與Bax的表達(dá)水平的變化。綜合分析結(jié)果，為高膽紅素血癥可以誘導(dǎo)健康人肝細(xì)胞的凋亡，并呈良好的劑量－效應(yīng)關(guān)系。這種現(xiàn)在也許就可以用高膽紅素血癥誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，部分的解釋“膽酶分離”現(xiàn)象高死亡率的原因。與以往對(duì)于肝臟衰竭的發(fā)生是肝細(xì)胞的急性大量死亡不能為細(xì)胞增生所補(bǔ)償?shù)慕Y(jié)果的認(rèn)識(shí)有所改變。本研究結(jié)果提示，高膽紅素血癥的時(shí)候，凋亡是肝細(xì)胞的第一反應(yīng)，而壞死則往往出現(xiàn)于細(xì)胞凋亡之后，肝細(xì)胞的凋亡過(guò)程對(duì)隨之出現(xiàn)的肝細(xì)胞壞死的行程起著至關(guān)重要的作用。也許可以試著從抑制細(xì)胞凋亡這個(gè)源頭來(lái)治療肝衰竭。在膽紅素到達(dá)一定水平時(shí)，給予積極的預(yù)防凋亡等治療以防止肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死。通過(guò)對(duì)Bcl－2、Bax基因的進(jìn)一步深入研究，有望為探討膽紅素誘導(dǎo)L－02細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制以及在高膽紅素血癥所指肝損害發(fā)生、發(fā)展中所其的作用提供理論依據(jù)。

［1］陳兆夷，陳兆武，李勝聯(lián)，等.體外膽紅素對(duì)L－02細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，24（32）：2656－2658.

［2］Berns M，Toennessen M，Koehne P，et al.Ibuprofen augments bilirubin toxicity in rat cortical neuronal culture［J］.Pediatr Res，2009，65（4）：392－396.

［3］Spfick MR，Walczak H.The interplay between the bcl－2 family and death receptor－mediated apoptosis［J］.Biochem Biophys Acta，2004，1644（2／3）：125－132.

［4］Di Nardo A，Benassi L，Magnoni C，et al.Ceramide 2（N－acetyl sphingosine）is associated with reduction in bcl－2 protein levels by Western blotting and with apoptosis in cultured human kerationocytes［J］.Dermatol，2000，143（3）：491－497.

［5］Heibein JA，Goping IS，Barry M，et al.Granzyme B－mediated cytochrome crelease is regu1ated by the bcl－2family members bid and Bax［J］.J Exp Med，2000，192（10）：1391－1402.

［6］冉立偉，譚升順，王萬(wàn)卷，等.全反式維A酸、阿維A和他扎羅汀對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞A375凋亡和Bax／Bcl－2蛋白表達(dá)的影響及意義［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25（8）：972－978.

［7］陳乃玲，白玲，鄧濤，等.慢性肝病肝細(xì)胞凋亡Fas、FasL、Bax、Bcl－2、Bcl－xl、Bcl－2等蛋 白 表 達(dá)［J］.中 華 傳 染病 雜志，2003，21（2）：122－124.

A research of the influence of bilirubin on the apoptosis of L－02 cell line and the expression of Bcl－2 and Bax

Chen Zhaoyi1，Chen Zhaowu2，Wang Guangming1，Deng Yanbu1，Liu Youli，Huang Zhigang1
（1.Department of Gastroenterology and Hepatlolgy，The People′s Hospital of Xuancheng City，Xuancheng，Anhui 242000，China；2，Department of Laboratory Medicine，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China）

ObjectiveTo investigate the influence of bilirubin on the apoptosis of L－02cell line in healthy human liver，and investigate the regulation of Bcl－2and Bax on the apoptosis process.MethodsThe L－02cells cultured in vitro and treated with bilirubin with the concentration 0，100，150，200，250，300mg／L respectively.The growth and apoptosis of L－02cell was assessed by flow cytometry Annexin V and PI；the expression of gene Bcl－2and Bax were detected by immunohistochemistry.ResultsImmunohistochemistry showed a negative expression of Bcl－2in the control group，a weak positive expression in the low concentration group and a strong positive expression in the high concentration group；and a visible expression of Bax in the control group，an increased expression in the low concentration group and a significantly increased strong positive expression in the high concentration group.This indicates that the expression of Bcl－2has a negative corelation with apoptotic rate nevertheless the Bax expression has a positive corelation.ConclusionBcl－2and Bax could regulate the apoptosis of L－02cell line induced by bilirubin and play an important role in the occurance and development of cell apoptosis.

bilirubin；apoptosis；L－02cells；Bcl－2；Bax

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.010

A

1671－8348（2012）35－3713－02

2012－06－13

2012－09－12）

·臨床研究·