臨床血液分離大腸埃希菌株耐藥性及生物被膜形成分析

熊 杰，楊繼勇，鄒自英，朱 冰，汪 璐，曾 平

（1.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都610083；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院微生物科，北京100853）

臨床血液分離大腸埃希菌株耐藥性及生物被膜形成分析

熊 杰1，楊繼勇2，鄒自英1，朱 冰1，汪 璐1，曾 平1

（1.中國(guó)人民解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都610083；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院微生物科，北京100853）

目的探討該院血流感染產(chǎn)超廣譜酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌（ECO）檢出率及其對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性及生物被膜形成能力。方法采用法國(guó)生物梅里埃公司的Vitek2－Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定和藥物敏感性分析，采用結(jié)晶紫半定量方法檢測(cè)菌株的生物被膜形成能力。結(jié)果92株ECO臨床血液分離菌株中，產(chǎn)ESBLs菌株53株（占57.61%），ESBLs陰性菌株39株（占42.39%）。對(duì)3類(lèi)以上抗菌藥物耐藥ECO 73株（占79.35%），其中，產(chǎn)ESBLs菌株52株，占總菌株數(shù)的56.52%，占產(chǎn)ESBLs菌株數(shù)的98.11%。耐藥率最高的為氨芐西林（94.57%），其次為頭孢唑啉（71.74%）和氨芐西林／舒巴坦（67.39%）；環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均在60%以上。對(duì)于臨床常用的氨芐西林／舒巴坦、頭孢菌素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)的妥布霉素和單酰胺類(lèi)抗菌藥物，與ESBLs陰性菌株相比，產(chǎn)ESBLs菌株的最小抑菌濃度（MIC）值顯著升高，耐藥率顯著升高（P＜0.05）。而對(duì)頭霉素類(lèi)、呋喃類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)的慶大霉素和阿米卡星、含酶抑制劑的哌拉西林／他唑巴坦和碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的敏感性ESBLs陽(yáng)性組與ESBLs陰性組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。96.74%的ECO臨床血液分離株具有生物被膜形成能力，生物被膜形成量以中量為主。結(jié)論該院ECO血液分離菌株產(chǎn)ESBLs比例高，生物被膜形成能力強(qiáng)，呈現(xiàn)多藥耐藥的特征。

血標(biāo)本；腸產(chǎn)毒性大腸桿菌；β內(nèi)酰胺酶類(lèi)；生物膜；抗藥性

大腸埃希菌（ECO）是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，是革蘭陰性桿菌中產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的代表菌種，分子流行病學(xué)研究結(jié)果表明，ESBLs基因型包括SHV、TEM、CTX－M型等，而CTX－M型是包括中國(guó)在內(nèi)的全球流行ESBLs基因型［1］。隨著頭孢菌素在臨床的廣泛應(yīng)用及產(chǎn)ESBLs菌株的增加，加速了耐藥質(zhì)粒的傳播，使ECO對(duì)多種廣譜和超廣譜抗菌藥物的耐藥性增加。同時(shí)，ECO是典型的生物被膜菌，細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌感染難以治愈和反復(fù)發(fā)作的重要原因［2］。本研究收集本院臨床送檢的所有血液標(biāo)本分離的ECO菌株，分析ESBLs的檢出情況及菌株的耐藥性，并檢測(cè)各菌株的生物被膜形成能力，為醫(yī)院ECO感染控制和臨床抗菌藥物使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 分離自2010年10月至2011年12月臨床送檢的血液標(biāo)本，同一患者的重復(fù)分離菌株不予統(tǒng)計(jì)。

1.2 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 采用法國(guó)梅里埃公司的Vitek2－Compact全自動(dòng)微生物分析儀及GN鑒定卡對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，AST－GN13藥敏卡檢測(cè)菌株的藥物敏感性。結(jié)果評(píng)價(jià)按2012年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M100－S22判斷。ASTGN13檢測(cè)的抗菌藥物：氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢替坦、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因。頭孢噻肟、頭孢噻肟／克拉維酸、頭孢他啶和頭孢他啶／克拉維酸藥敏紙片為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3 ESBLs確證試驗(yàn) AST－GN13藥敏卡通過(guò) Vitek2－Compact全自動(dòng)微生物分析儀檢測(cè)提示ESBLs陽(yáng)性菌株均按CLSI推薦的方法，將0.5麥?zhǔn)蠁挝痪壕鶆蛲坎?M－H平板，將頭孢噻肟（30μg）和頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10μg）、頭孢他啶（30μg）和頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg）黏貼在涂布菌液的M－H平板上，35℃培養(yǎng)18h，測(cè)量抑菌圈直徑，兩對(duì)紙片或其中任何一對(duì)紙片的直徑相差大于或等于5mm，即為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.4 質(zhì)控菌株 陰溝腸桿菌ATCC700323、ECO ATCC25922、ESBLs陽(yáng)性肺炎克雷伯菌ATCC700603購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.5 細(xì)菌生物膜半定量檢測(cè) 采用半定量結(jié)晶紫染色法，操作方法參照文獻(xiàn)［2］，略作改動(dòng)。將菌液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用新鮮M－H培養(yǎng)液調(diào)節(jié)菌液濃度為1×109CFU／mL，接種于96孔板中，每孔200μL，每株菌設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃靜止培養(yǎng)48h，24h換液1次。輕輕棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）（每孔200 μL）輕柔的清洗4次，棄去上清液。每孔加入Bouin′S固定液50μL，固定1h，輕輕倒去液體，PBS清洗4次。每孔加入50 μL結(jié)晶紫，染色2min，輕輕倒去液體。用自來(lái)水輕輕沖洗96孔板，直至陰性對(duì)照沒(méi)有顏色，室溫晾干，95%乙醇脫色。酶標(biāo)儀測(cè)定A570，陰性對(duì)照組為M－H培養(yǎng)液。生物膜形成量判斷標(biāo)準(zhǔn)：以陰性對(duì)照的平均A570加標(biāo)準(zhǔn)差定義為Ac，待測(cè)菌株A與Ac比較，將菌株生物膜形成能力分為4類(lèi)：陰性（－）：A＜Ac；少量（1＋）：Ac＜A≤2Ac；中量（2＋）：2Ac＜A≤4Ac；大量：A＞4Ac。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 WHONET4.5軟件錄入數(shù)據(jù)分析。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間分析采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ECO臨床血液分離株的耐藥性分析 92株ECO臨床血流分離菌株中，產(chǎn)ESBLs菌株53株，占57.61%，ESBLs陰性菌株39株，占42.39%。對(duì)3類(lèi)以上抗菌藥物耐藥ECO 73株，占79.35%，其中，產(chǎn)ESBLs菌株52株，占總菌株數(shù)的56.52%，占產(chǎn)ESBLs菌株數(shù)的98.11%。ECO臨床血液分離株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性，見(jiàn)表1。

2.2 ECO臨床血液分離株的生物被膜半定量檢測(cè)結(jié)果96.74%的ECO臨床血液分離株具有產(chǎn)生生物被膜能力，以產(chǎn)生中量生物被膜菌株比例最高（75.00%）。ECO臨床血液分離株產(chǎn)生生物被膜能力，見(jiàn)表2。

表1 臨床血液分離ECO對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率（%）

續(xù)表1 臨床血液分離ECO對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率（%）

表2 臨床血液分離ECO生物被膜形成能力

3 討 論

ESBLs是由質(zhì)粒介導(dǎo)的一類(lèi)β－內(nèi)酰胺酶，能水解含氧亞氨基的β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，并可被β－內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸抑制。本研究結(jié)果顯示，92株ECO臨床分離株檢出產(chǎn)ESBLs菌株53株，占57.61%，高于多篇文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率［3－8］，ESBLs的高檢出率，給臨床抗感染治療帶來(lái)很大壓力和挑戰(zhàn)，隨著抗菌藥物的不合理使用，ESBLs菌株的檢出率勢(shì)必還將持續(xù)升高。92株ESBLs菌株對(duì)亞胺培南、厄他培南、頭孢替坦、哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星和呋喃妥因較敏感，耐藥率小于10%，與ESBLs陰性菌株比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)氨芐西林的耐藥率達(dá)到100%，而氨芐西林／舒巴坦的耐藥率也達(dá)到83.02%，頭孢曲松和頭孢唑啉的耐藥率均大于95%，氨曲南、頭孢他啶和頭孢吡肟的耐藥率分別為58.49%、35.85%和26.42%，與 ESBLs陰性菌株比較耐藥率顯著升高（P＜0.05）；按照2008年 CLSI M100－S18標(biāo)準(zhǔn)，ESBLs菌株所有β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物均應(yīng)判定為耐藥，自2010年CLSI對(duì)折點(diǎn)進(jìn)行修正后，就提出不必常規(guī)進(jìn)行ESBLs檢驗(yàn)，2012年CLSI M100－S22明確指出，采用更新后的折點(diǎn)，不必將頭孢菌素類(lèi)、青霉素類(lèi)和氨曲南的藥敏結(jié)果從敏感修正為耐藥，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ESBLs主要用于流行病學(xué)調(diào)查和醫(yī)院感染控制［9］。因此，新標(biāo)準(zhǔn)增加了這幾類(lèi)抗菌藥物用于臨床治療腸桿菌科細(xì)菌的機(jī)會(huì)，雖然在臨床治療中還存在一定的爭(zhēng)議。本研究結(jié)果提示，ESBLs仍然是臨床抗菌藥物選擇的一個(gè)不容忽視的限制性因素，臨床若選擇β－內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物治療ESBLs ECO感染，則需根據(jù)MIC值慎重選擇敏感抗菌藥物，且承擔(dān)治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)加大。鑒于本院ESBLs的高檢出率，仍然常規(guī)檢測(cè)和報(bào)告ESBLs，既不減少臨床抗菌藥物選擇的機(jī)會(huì)，又提醒臨床需慎重選擇。氟喹諾酮類(lèi)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)產(chǎn)ESBLs的ECO菌株耐藥率均大于85%，可能與ESBLs基因常與質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因共存有關(guān)，在產(chǎn)ESBLs的ECO中，同時(shí)檢測(cè)到qnr基因攜帶及gyrA基因和parC基因變異，而這些基因的存在和變異使得細(xì)菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物高度耐藥［10］。氨基糖苷類(lèi)妥布霉素和慶大霉素對(duì)ESBLs菌株的耐藥率達(dá)到22.64%和64.15%，而且由于氨基糖苷類(lèi)的肝腎毒性，限制了該類(lèi)藥物在臨床的應(yīng)用，常常作為聯(lián)合用藥的一部分。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs的ECO呈現(xiàn)對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)等多種藥物的耐藥性。ESBLs陰性ECO菌株對(duì)大部分抗菌藥物均有較高的敏感率，除氨芐西林外，檢測(cè)的其余抗菌藥物的敏感率均大于50%。ESBLs為質(zhì)粒介導(dǎo)的可通過(guò)結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在同種病原菌間甚至不同種病原菌間進(jìn)行耐藥性傳播，攜帶ESBLs菌株可引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行。因此，規(guī)范抗菌藥物的合理應(yīng)用和監(jiān)測(cè)ESBLs耐藥菌的傳播和流行應(yīng)當(dāng)作為醫(yī)院感染控制的一個(gè)常規(guī)性工作。

有研究報(bào)道生物被膜菌與游離態(tài)細(xì)菌相比耐藥性大幅度提高，生物被膜是細(xì)菌感染難以治愈和反復(fù)發(fā)作的重要原因［11］。本研究結(jié)果提示，96.74%的ECO血液分離菌可以形成生物被膜，而形成被膜的量以中量居多，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［2］。ECO被膜菌耐藥性升高與rpoS基因的表達(dá)增加密切相關(guān)，而rpoS基因又調(diào)節(jié)一系列與生物被膜形成、黏附、增殖、成熟等各個(gè)階段相關(guān)基因的表達(dá)，使得被膜菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性增強(qiáng)［11］。傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)測(cè)得的MIC是針對(duì)單個(gè)游離的細(xì)菌，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，采用被膜菌測(cè)得的最小殺菌濃度（BIC）與傳統(tǒng)的MIC存在很大差異，兩類(lèi)藥敏試驗(yàn)篩選出的敏感抗菌藥物也存在很大差異，因此只以MIC指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用，對(duì)生物被膜菌的感染治療難以達(dá)到滿意的結(jié)果［12］。由于絕大多數(shù)ECO菌株均能形成生物被膜，在臨床治療相關(guān)感染若依據(jù)傳統(tǒng)藥敏結(jié)果療效不佳時(shí)，選擇生物被膜敏感的抗菌藥物，以提高抗感染治療的效果。

ECO是目前臨床血液標(biāo)本最常見(jiàn)的分離菌株之一，作為機(jī)會(huì)致病菌，對(duì)ECO特別是ESBLs菌的感染重在預(yù)防。高齡、低免疫力和長(zhǎng)期住院患者是ESBLs菌的易感對(duì)象，長(zhǎng)期激素、放化療和介入治療是ESBLs菌感染的高危因素。因此，合理使用抗菌藥物，減少激素的使用，加強(qiáng)醫(yī)務(wù)人員無(wú)菌觀念和嚴(yán)格的消毒隔離措施，及時(shí)更換或拔除各類(lèi)導(dǎo)管和合理使用呼吸機(jī)等，均有利于預(yù)防和減少產(chǎn)ESBLs的ECO的感染和傳播。

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Antibiotics susceptibility and ability of biofilm formation of escherichia coli strains isolated from blood specimens

Xiong Jie1，Yang Jiyong2，Zou Ziying1，Zhu Bing1，Wang Lu1，Zeng Ping1
（1.Department of Clinical Laboratory，PLA Chengdu Military Aera Command General Hospital，Chengdu，Sichuan610083，China；2.Department of Microbiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing100853，China）

ObjectiveTo approach the drug resistance of Escherichia coli isolated from blood producing extendedβlactamases（ESBLs）and its ability of biofilm formation，and provide guidance for clinical medication and nosocomial infection control.MethodsEscherichia coli identification and drug sensitivity was detected using Vitek2Compact of biomerieux.The method of microtiter plate culture crystal violet stain was used for quantitative analysis of biofilm formation.ResultsA total of 53（57.61%）Escherichia coli producing ESBLs were isolated from 92Escherichia coli clinical strains.And which didn′t produce ESBLs were 39（42.39%）strains.Escherichia coli that resistant to more than three kinds of antibiotics was 73strains（79.35%），in which 52producing ESBLs（56.52%）.The most resistant antibiotic was ampicillin（94.57%），the next was cefazolin（71.74%）and ampicillin／sulbactam（67.39%）.The resistant rate of ciprofloxacin and levofloxacin was over 60%.The MIC of ESBLs strains of antibiotics often used by clinical including ampicillin／sulbactam，cephems，fluoroquinolones，tobramycin and monobactams was increased significantly compared with ESBLs negative strains.The resistant rate of ESBLs strains compared with ESBLs negative strains increased（P＜0.05）.Cefotetan，nitrofurans，amikacin and gentamicin，piperacillin／tazobactam and carbapenems were susceptible both to ESBLs strains and ESBLs negative strains（P＞0.05）.96.74%of the 92Escherichia coli strains had the ability of biofilm forming，and most isolates formed medium or more quantity of biofilm.ConclusionThe isolating rate of Escherichia coli from blood producing ESBLs was much higher than most hospital that had reported，and having strong ability to form biofilm and resistant to many different kinds of antibiotics.

blood samples；enterotoxigenic；escherichia coli；β－lactamases；biofilms；drug resistance

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.005

A

1671－8348（2012）35－3699－03

2012－06－13

2012－09－12）

·臨床研究·