日本血吸蟲(chóng)p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗免疫對(duì)小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫形成的影響＊

彭 微，汪世平，鄭長(zhǎng)黎，宋海鵬，劉 懷

業(yè)已證明，疫苗是人們控制傳染性疾病傳播的最為經(jīng)濟(jì)有效的措施之一。近幾年來(lái)，中南大學(xué)湘雅血吸蟲(chóng)病研究室先后構(gòu)建了幾種抗日本血吸蟲(chóng)病天然分子疫苗編碼基因相關(guān)的核酸疫苗，其中包括編碼SIEA26－28 k Da分子抗原的p VAX1／Sj RPS4，以及編碼Sj31／32k Da分子抗原的p VAX1／Sj CB等。在此基礎(chǔ)上，本研究將已經(jīng)構(gòu)建成功的p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗免疫小鼠，進(jìn)一步觀察疫苗免疫后對(duì)小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的病理形態(tài)學(xué)改變及周長(zhǎng)和面積的影響，從而為該疫苗的免疫保護(hù)力研究提供有意義的形態(tài)學(xué)資料。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 陽(yáng)性釘螺系中南大學(xué)湘雅血吸蟲(chóng)病研究室提供，從人工毛蚴感染釘螺后篩選獲得；清潔級(jí)昆明小鼠，雌性，體重25～30 g，由湘雅中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。

1．2 質(zhì)粒 p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／Sj CB、p VAX1／Sj RPS4·CB由湘雅血吸蟲(chóng)病研究室構(gòu)建并保存。

1．3 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)方案 55只昆明小鼠隨機(jī)分成5組：PBS對(duì)照組、p VAX1空質(zhì)粒組、p VAX1／Sj RPS4單價(jià)疫苗組、p VAX1／Sj CB單價(jià)疫苗組、p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組。每組注射相應(yīng)質(zhì)粒100μg或等量PBS，注射部位為左后腿股四頭肌。每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共3次。末次免疫后2周經(jīng)腹部皮膚攻擊感染20±1條日本血吸蟲(chóng)尾蚴，感染后第6周處死小鼠。

1．4 肝組織石蠟切片及HE染色 隨機(jī)自各組取5只小鼠剖殺，肝組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟組織塊，制成10μm的連續(xù)切片，按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色。

1．5 蟲(chóng)卵肉芽腫周長(zhǎng)和面積的測(cè)量 采用UVP成像系統(tǒng)，在100×視野下，每組選取15個(gè)肉芽腫，測(cè)量肉芽腫的面積和周長(zhǎng)，測(cè)量數(shù)據(jù)采用方差分析檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié) 果

2．1 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化 肝組織切片鏡下顯示，PBS對(duì)照組肝組織中肝細(xì)胞變性、壞死，可見(jiàn)大量的蟲(chóng)卵肉芽腫形成，肉芽腫體積較大，肉芽腫內(nèi)有多個(gè)蟲(chóng)卵聚集，周圍有大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，蟲(chóng)卵周圍可見(jiàn)到少量梭形的成纖維細(xì)胞及類上皮細(xì)胞（圖1）。p VAX1空質(zhì)粒組也可見(jiàn)大量肉芽腫，周圍有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，但是肝細(xì)胞變性壞死程度較PBS對(duì)照組輕（圖1）。p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／Sj CB組疫苗免疫，尾蚴攻擊后肝臟病變大致相同，其病變明顯減輕，小鼠肝細(xì)胞混濁腫脹，匯管區(qū)蟲(chóng)卵肉芽腫數(shù)量減少，體積減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)主要以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖1）。p VAX1／Sj RPS4·CB病變程度最輕，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，蟲(chóng)卵肉芽腫周圍炎癥反應(yīng)輕，細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，肉芽腫面積較?。▓D1）。

2．2 對(duì)蟲(chóng)卵肉芽腫形成影響的觀察 對(duì)肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫測(cè)量發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫、尾蚴攻擊后，疫苗組的肉芽腫平均周長(zhǎng)分別與p VAX1空質(zhì)粒組、PBS對(duì)照組相比，均數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6705．41，P＜0．05）；其肉芽腫平均面積分別與p VAX1空質(zhì)粒組、PBS對(duì)照組相比，均數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2 901．28，P＜0．05）。兩組單價(jià)疫苗組和多價(jià)疫苗組相比，蟲(chóng)卵肉芽腫的平均面積和周長(zhǎng)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表1。

表1 疫苗免疫、尾蚴攻擊后小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫測(cè)量結(jié)果Tab．1 Results of egg granulomas measurement after the vaccine i mmunized mice challenged by Sj cercariae

3 討 論

圖1 肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫HE染色（×100）A ：p VAX1組 （HE染色×100）；B：PBS組（HE染色×100）；C：p VAX1／Sj RPS4組（HE染色×100）；D：p VAX1／Sj CB組（HE染色×100）；E：p VAX1／Sj RPS4·CB組（HE染色×100）Fig．1 Liver egg granulomas（HE staining，×100）A：p VAX1 group；B：PBS group；C：p VAX1／Sj RPS4 group；D：p VAX1／Sj CB gr oup；E：p VAX1／Sj RPS4·CB gr oup

血吸蟲(chóng)病的主要病變是蟲(chóng)卵引起肝臟和腸壁組織發(fā)生蟲(chóng)卵肉芽腫和組織纖維化。因此，肝組織的病理學(xué)改變可以直接反映疫苗的抗病效果。包括蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)的數(shù)目、大小、肝臟組織病理變化等。段義農(nóng)等［1］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)SEA處理的小鼠感染血吸蟲(chóng)后，肝臟中蟲(chóng)卵肉芽腫的直徑小于對(duì)照組。李文桂等［2］研究顯示用BCG－Sj 26GST疫苗接種小鼠后肝臟肉芽腫數(shù)目少，體積小，平均周長(zhǎng)和平均面積小于對(duì)照組。應(yīng)用重組Sj26 GST（reSjc GST）抗原免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生18．2%～30．5%的減蟲(chóng)率和21．7%～59%的減卵率，同時(shí)肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫明顯變?。?］。Mah moud H Ro meih 等［4］對(duì)埃及曼氏血吸蟲(chóng)疫苗研究中發(fā)現(xiàn)免疫組較對(duì)照組肉芽腫結(jié)節(jié)數(shù)減少，體積減小。嗜酸性粒細(xì)胞減少明顯。萬(wàn)中原等［5］從日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分離純化出天然28、31／32和97 k D蛋白，混合成多價(jià)疫苗免疫小鼠，獲得較高的減蟲(chóng)率和肝減卵率，而且研究發(fā)現(xiàn)疫苗具有一定的抑制蟲(chóng)卵肉芽腫的作用。秦永華等［6］發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗免疫昆明小鼠，尾蚴攻擊感染后減蟲(chóng)率為25．2%～31．3%，每雌減卵率為24．1%～31．5%，每克肝減卵率為44．9%～58．8%，提示該疫苗可產(chǎn)生較好的保護(hù)性免疫反應(yīng)。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組免疫小鼠后的組織切片進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，肝臟病變程度較輕，蟲(chóng)卵數(shù)量較少，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少。隨后，測(cè)量其肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的周長(zhǎng)和面積，同樣發(fā)現(xiàn)肉芽腫的平均面積和周長(zhǎng)有明顯減小，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），表明p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組具有明顯的抑制蟲(chóng)卵肉芽腫的效果，蟲(chóng)卵結(jié)節(jié)明顯減小。

多價(jià)DNA疫苗是將不同抗原分子序列的堿基通過(guò)一定的方式連接在一起，共同插入到同一真核載體內(nèi)，并在宿主體內(nèi)共表達(dá)。石佑恩等［7］用RTPCR從成蟲(chóng)體內(nèi)擴(kuò)增Sj GST，構(gòu)建大腸桿菌－分支桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒PBCG－Sj 26 I－IV，再將其依次轉(zhuǎn)化到大腸桿菌、恥垢分枝桿菌中，篩選出重組恥垢分枝桿菌疫苗和重組BCG多價(jià)疫苗，用以免疫小鼠，獲得27．36%減蟲(chóng)率和60．50%的肝卵減少率。

張冉等［8］發(fā)現(xiàn)多價(jià)疫苗 VR1012－Sj GST－Sj 31和VR1012－Sj GST－Sj 32均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗血吸蟲(chóng)感染保護(hù)作用，其免疫效果大于單價(jià)疫苗。

以 多 價(jià) DNA 疫 苗 p BK－Sj 26－Sj 23 和 p BKSj 23－Sj 23免疫小鼠能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。減蟲(chóng)率為28．12%和28．50%，與單價(jià)疫苗比較有所提高。［9］

王曉婷［10］的研究中同樣也發(fā)現(xiàn) pc DNA3．1－TPI－linker－（CDR3）6多價(jià)DNA 疫苗減蟲(chóng)率和減卵率均顯著高于單價(jià)DNA疫苗組。證明多價(jià)DNA聯(lián)合疫苗中的各單價(jià)分子發(fā)揮協(xié)同作用，比單價(jià)DNA疫苗抗感染力有了明顯提高，對(duì)宿主的保護(hù)力顯著增強(qiáng)［11］。從而解決了單價(jià)DNA疫苗免疫力保護(hù)力低的問(wèn)題。本研究p VAX1／Sj RPS4·CB多價(jià)疫苗組和p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／CB單價(jià)疫苗組相比，肝臟組織切片病變程度更輕，肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫周長(zhǎng)和面積有明顯減小，提示多價(jià)疫苗比單價(jià)疫苗抑制蟲(chóng)卵肉芽腫的作用更好，可以產(chǎn)生比單價(jià)疫苗更優(yōu)的免疫保護(hù)效果。

總之，基因重組DNA聯(lián)合疫苗具有增強(qiáng)免疫保護(hù)力，減少免疫次數(shù)，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本等特點(diǎn)。而且，不存在雞尾酒式混合疫苗中可能增加的毒素問(wèn)題，具有廣泛的研究前景和開(kāi)發(fā)價(jià)值。p VAX1載體是通過(guò)pc DNA3．1改良而新開(kāi)發(fā)的被美國(guó)藥品及食品鑒定委員會(huì)驗(yàn)證批準(zhǔn)的用于疫苗臨床使用的真核表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)采用它作為多價(jià)疫苗的載體，為日本血吸蟲(chóng)疫苗今后在臨床的應(yīng)用提供了一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。

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