微小隱孢子蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法的探索＊

史亞?wèn)|，董海聚，王榮軍，張龍現(xiàn)，寧長(zhǎng)申，菅復(fù)春

隱孢子蟲(chóng)是一種腸道原生寄生蟲(chóng)，可以引起人和動(dòng)物的隱孢子蟲(chóng)病。該病的最主要癥狀是腹瀉，已被列為世界最常見(jiàn)的6種腹瀉病之一［1］，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國(guó)疾病控制中心（CDC）列入新發(fā)傳染病。隱孢子蟲(chóng)大小一般為5～8μm，常用的檢測(cè)方法可以分為病原學(xué)檢測(cè)（主要借助顯微鏡）、免疫學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)3類(lèi)［2］，分子生物學(xué)檢測(cè)因其優(yōu)勢(shì)較多而廣泛應(yīng)用。Noto mi等［3］2000年建立了一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、特異并且低成本的核酸擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LA MP），這種新穎的核酸擴(kuò)增方法可以在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)單地得出檢測(cè)結(jié)果，這種優(yōu)勢(shì)使其在病原分子檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，如應(yīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等病原的檢測(cè)［4－7］。

1 材料與方法

1．1 蟲(chóng)種 本實(shí)驗(yàn)室保存的微小隱孢子蟲(chóng)（Cr yptosporidiu m par vu m）、賈第蟲(chóng)（Giar dia sp）、腸阿米巴（Enta moeba sp）、球蟲(chóng)（Ei meria tenell a）和類(lèi)圓線蟲(chóng)（Str ongyloides sp）5種陽(yáng)性樣品。

1．2 主要試劑和儀器 Bst DNA聚合酶大片段（Bst DNA pol y merase lar ge frag ment）購(gòu)自 NEB公司，三甲銨乙內(nèi)酯（Betaine）購(gòu)自Sig ma公司，Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Mar ker和脫氧核苷三磷酸（d NTP Mixt ure）購(gòu)自Ta Ka Ra公司，MseI內(nèi)切酶購(gòu)自 Fer mentas公司，SYBR Green I（10 000×）購(gòu)自Solarbio公司，E．Z．N．A．?Stool DNA Kit（糞便DNA提取試劑盒）購(gòu)自O(shè)MEGA公司。電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司，型號(hào)HwS24），穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY－5），凝膠成像儀（SYNGENE公司，型號(hào)In－Genius L HR）。

1．3 DNA的提取 按照E．Z．N．A．?Stool DNA Kit說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)保存的不同蟲(chóng)株陽(yáng)性樣品提取DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 引物設(shè)計(jì)選擇及合成 袁忠英等［8］在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道用LA MP檢測(cè)牛源隱孢子蟲(chóng)卵囊，其根據(jù)微小隱孢子蟲(chóng)18s r RNA基因序列（Gen Bank登錄號(hào)3873244）設(shè)計(jì)了4條隱孢子蟲(chóng)特異性引物（F3、B3、FIP、BIP）。根據(jù)這4條引物利用Pri mer Explorer V4（htt p：／／pri merexplorer．jp／elamp4．0．0／index．ht ml）設(shè)計(jì)了2條環(huán)引物（LF、LB，序列見(jiàn)表1）。引物由華大基因合成。

表1 微小隱孢子蟲(chóng)LAMP引物序列Tab．1 The sequence of LAMP primers for Cr yptosporidium parvum

1．5 LA MP反應(yīng)和PCR反應(yīng)建立 根據(jù)文獻(xiàn)［3］，設(shè)定LA MP反應(yīng)初始體系組成為：FIP和BIP各1．6μmol／L，F(xiàn)3和 B3各0．2μmol／L，1．4 mmol／L d NTP Mixt ure，0．8 mol／L Betaine，20 mmol／L Tris－HCl（p H 8．8），10 mmol／L KCl，10 mmol／L（NH4）2SO4，8 mmol／L Mg SO4，0．1%Tween20，DNA模板2μL，加雙蒸水至25μL。反應(yīng)混合物先在95℃加熱5 min使DNA解鏈，放在冰上冷卻5 min后加8 U Bst DNA聚合酶大片段，然后在65℃孵育1 h，最后在80℃10 min終止反應(yīng)。分別取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［9－10］，選擇 LA MP 引物中的 F3和B3作為PCR上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為193 bp。25μL PCR體系中包括1×PCR Buffer，上下游引物各0．4μmol／L，d NTP Mixt ure 2 mmol／L，Taq DNA 聚合酶0．625 U，2μL模板DNA，加雙蒸水至25μL。反應(yīng)過(guò)程為：95℃變性5 min，95℃45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1．6 LA MP反應(yīng)的優(yōu)化

1．6．1 反應(yīng)過(guò)程、時(shí)間、溫度的優(yōu)化 選用同一份微小隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，做A、B、C 3組擴(kuò)增反應(yīng)，每組做3個(gè)重復(fù)；并用雙蒸水做空白對(duì)照。其中設(shè)置B組和空白對(duì)照在水浴鍋中95℃反應(yīng)5 min、65℃反應(yīng)60 min、80℃終止反應(yīng)10 min；A組不經(jīng)過(guò)95℃5 min熱變性過(guò)程，C組不經(jīng)過(guò)80℃10 min終止反應(yīng)過(guò)程，其余反應(yīng)條件均相同。

設(shè)置反應(yīng)溫度分別為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，觀察對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響，并做陰性對(duì)照，陰性對(duì)照溫度為63℃。

設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min，并做陰性對(duì)照，陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)間為60 min。

1．6．2 反應(yīng)體系組成的優(yōu)化 對(duì)體系中的Beta－ine、MgSO4、d NTP Mixt ure濃度，酶工作濃度和外內(nèi)引物比等進(jìn)行優(yōu)化。

設(shè)置Betaine的終濃度梯度為：0．2 mol／L、0．4 mol／L、0．6 mol／L、0．8 mol／L、1．0 mol／L、1．2 mol／L、1．4 mol／L，陰性對(duì)照的終濃度為0．8 mol／L，其他條件相同。

設(shè)置 MgSO4的終濃度梯度為：2 mmol／L、4 mmol／L、6 mmol／L、8 mmol／L、10 mmol／L、12 mmol／L、14 mmol／L，陰 性 對(duì) 照 的 終 濃 度 為 8 mmol／L，其他條件相同。

設(shè)置d NTP Mixture的終濃度梯度為：0．8 mmol／L、1．0 mmol／L、1．2 mmol／L、1．4 mmol／L、1．6 mmol／L、1．8 mmol／L、2．0 mmol／L，陰性對(duì)照的終濃度為1．4 mmol／L，其他條件相同。

設(shè)置酶的終濃度梯度為：2 U／25μL、4 U／25 μL、6 U／25μL、8 U／25μL、10 U／25μL、12 U／25 μL、14 U／25μL，陰性對(duì)照的終濃度8 U／25μL其他條件相同。

L MAP反應(yīng)中F3和B3引物的濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響很?。?］，本研究中固定外引物F3和B3的濃度（0．2μmol／L），把內(nèi)引物FIP和BIP的濃度進(jìn)行梯度優(yōu)化，按外內(nèi)引物比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14進(jìn)行，陰性對(duì)照的外內(nèi)引物比為1∶8，其他條件相同。

1．6．3 添加環(huán)引物對(duì)反應(yīng)的影響 反應(yīng)體系中添加環(huán)引物（LF、LB各0．8μmol／L，25μL體系），設(shè)置反應(yīng)時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，其他條件不變。

1．7 LA MP特異性試驗(yàn) 分別選用微小隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)、腸阿米巴、球蟲(chóng)、類(lèi)圓線蟲(chóng)DNA作為模板進(jìn)行LA MP反應(yīng)，并用雙蒸水做空白對(duì)照，每個(gè)體系模板量為2μL，其他條件相同。

1．8 LA MP敏感性試驗(yàn) 對(duì)經(jīng)蔗糖梯度濃集并計(jì)數(shù)的100萬(wàn)微小隱孢子蟲(chóng)卵囊（100μL，1 000萬(wàn)／m L）提取DNA，把DNA分別稀釋為原液的10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6倍（相當(dāng)于5×102、5×101、5×100、5×10－1、5×10－2、5×10－3個(gè)卵囊／μL，原液相當(dāng)于5×103個(gè)卵囊／μL）；用這些梯度DNA樣品來(lái)檢測(cè)LA MP方法的敏感性，并和常規(guī)PCR方法比較。

1．9 產(chǎn)物酶切試驗(yàn) 對(duì)LA MP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MseI酶消化，30μL反應(yīng)體系成分為：10μL LA MP擴(kuò)增產(chǎn)物，1μL MseI酶，2μL10×Buffer R（隨酶提供），加雙蒸水至30μL。65℃孵育10 h。取5μL消化后產(chǎn)物2．0%瓊脂糖凝膠電泳（低電壓），觀察結(jié)果。

1．10 LA MP產(chǎn)物的檢測(cè)方法的比較 本研究選用的LA MP產(chǎn)物檢測(cè)方法有：1．凝膠電泳；2．可見(jiàn)光下直接觀察濁度；3．3 000 r／min離心2 min，觀察沉淀；4．添加1μL1000×SYBR Green I顯色后直接光觀察；5．添加1μL 1000×SYBR Green I顯色紫外成像觀察。

2 結(jié) 果

2．1 反應(yīng)過(guò)程、時(shí)間、溫度的優(yōu)化結(jié)果 A、B、C3組擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，均出現(xiàn)LA MP特征性梯形條帶，95℃5 min熱變性過(guò)程和80℃10 min終止反應(yīng)過(guò)程對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)影響不大，陰性對(duì)照無(wú)條帶，見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)熱變性和酶失活這兩個(gè)過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不明顯。這和Kentar o等［11］報(bào)道的用濁度儀檢測(cè)LA MP擴(kuò)增熱變性和非熱變性模板的結(jié)果相一致。因此，在檢測(cè)樣品較多、現(xiàn)場(chǎng)臨床檢測(cè)等情況下可以省去這兩個(gè)過(guò)程以節(jié)省時(shí)間。

最佳反應(yīng)溫度為63℃，見(jiàn)圖2。擴(kuò)增反應(yīng)在50 min時(shí)出現(xiàn)清晰條帶，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min，見(jiàn)圖3。

圖1 不同反應(yīng)過(guò)程對(duì)LAMP的影響Fig．1 Effect of different reaction process on the LAMP M：DL2000 DNA marker；1－3（A）：65℃for 60 min，80℃for 10 min；4－6（B）：95℃for 5 min，65℃for 60 min，80℃for 10 min；7－9（C）：95℃for 5 min，65℃for 60 min；10：Negative control

2．2 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果 體系中 Mg SO4、d NTP Mixture、酶的最佳濃度分 別 為 8 mmol／L、0．8 mmol／L、8 U／25μL。外內(nèi)引物最佳比為1∶6，由于外引物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很?。?］，所以實(shí)驗(yàn)中固定外引物濃度，對(duì)內(nèi)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。Betaine的濃度在1．0 mol／L以下幾個(gè)濃度均展現(xiàn)了較清晰的條帶，也有報(bào)道［12］不添加Betaine成功擴(kuò)增的，但Notomi等［3］報(bào)道反應(yīng)體系中有0．5～1．5 mol／L Beta－ine存在的情況下，Betaine會(huì)促進(jìn)DNA雙鏈解鏈，同時(shí)會(huì)使堿基的堆積和非特異性擴(kuò)增減少，最終提高反應(yīng)效率。因此，我們選用0．8 mol／L作為Betaine最佳濃度，分別見(jiàn)圖4、5、6。

圖2 溫度對(duì)LAMP的影響Fig．2 Effect of temperature on the LAMP M：DL2000 DNA marker；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃；5：64℃；6：65 ℃；7：Negative control，63℃

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP的影響Fig．3 Effect of reaction time on the LAMP M：DL2000 DNA mar ker；1：20 min；2：30 min；3：40 min；4：50 min；5：60 min；6：70 min；7：80 min；8：90 min；9：100 min；10：Negative control，60 min

圖4 Betaine濃度對(duì)LAMP的影響Fig．4 Effect of Betaine concentration on the LAMP M：DL2000 DNA Mar ker；1：0．2 mol／L；2：0．4 mol／L；3：0．6 mol／L；4：0．8 mol／L；5：1．0 mol／L；6：1．2 mol／L；7：1．4 mol／L；8：Negative control，0．8 mol／L

2．3 環(huán)引物的效果 反應(yīng)體系中添加環(huán)引物后，LA MP出現(xiàn)清晰條帶的時(shí)間縮短到了20 min，見(jiàn)圖7。Naga mine等［13］第一次報(bào)道使用環(huán)引物來(lái)加速LA MP反應(yīng)過(guò)程，使用環(huán)引物的LA MP反應(yīng)時(shí)間會(huì)比未使用環(huán)引物的LA MP反應(yīng)大大縮短。如此短的反應(yīng)時(shí)間將有利于該方法用于臨床快速檢測(cè)。

圖5 酶的濃度對(duì)LAMP的影響Fig．5 Effect of the enzyme concentr ation on the LAMP M：2 000 bp DNA mar ker；1：2 U／25μL；2：4 U／25μL；3：6 U／25μL；4：8 U／25μL；5：10 U／25μL；6：12 U／25μL；7：14 U／25μL；8：Negative control，8 U／25μL

圖6 外內(nèi)引物比對(duì)LAMP的影響Fig．6 Effect of ratio of outer and inner primer on the LAMP M：2 000 bp DNA mar ker；1：1／2；2：1／4；3：1／6；4：1／8；5：1／10；6：1／12；7：1／14；8：Negative control，1／8

圖7 LAMP使用環(huán)引物的反應(yīng)時(shí)間Fig．7 The reaction ti me of using loop pri mers on the LAMP M：DL2000 DNA marker；1：10 min；2：20 min；3：30 min；4：40 min；5：50 min；6：60 min；7：70 min；8：80 min；9：90 min

圖8 LAMP和PCR的靈敏度試驗(yàn)Fig．8 Detection li mit of LAMP and PCR M：DL2000 DNA marker；1：5×10 3 oocysts／μL；2：5×10 2 oocysts／μL；3：5×10 1 oocysts／μL；4：5×10 0 oocysts／μL；5：5×10－1 oocyst／μL；6：5×10－2 oocyst／μL；7：5×10－3 oocyst／μL；8：Negative control

2．4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果與分析 從圖8中看出使用相同模板，LA MP的檢測(cè)限度是5×100個(gè)卵囊／μL（圖8 A），而PCR的檢測(cè)限度是5×102個(gè)卵囊／μL（圖8B）。在LA MP的產(chǎn)物中添加染料SYBR Green I也得到了同電泳一樣的結(jié)果（圖8C）。

2．5 特異性試驗(yàn)結(jié)果與分析 特異性試驗(yàn)如圖9所示，僅微小隱孢子蟲(chóng)出現(xiàn)LAMP特異梯狀條帶，賈第蟲(chóng)、腸阿米巴、球蟲(chóng)、類(lèi)圓線蟲(chóng)及雙蒸水無(wú)特異梯狀條帶，特異性好。

2．6 酶切后電泳結(jié)果與分析 LA MP產(chǎn)物經(jīng)Mse I酶消化理論上會(huì)產(chǎn)生111 bp、65 bp、46 bp 3個(gè)片段，在電泳圖上100 bp附近及下方出現(xiàn)3個(gè)亮帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖10。

圖9 LAMP的特異性試驗(yàn)結(jié)果M：2 000 bp DNA mar ker；1：微小隱孢子蟲(chóng)；2：賈第蟲(chóng)；3：腸阿米巴；4：球蟲(chóng)；5：類(lèi)圓線蟲(chóng)；6：雙蒸水Fig．9 The result of LAMP specificity test M：2 000 bp DNA mar ker；1：C．par vu m；2：Giar dia sp；3：Entamoeba sp；4：Ei meria tenell a；5：Strongyloides sp；6：Double distilled water

圖10 LAMP產(chǎn)物酶切圖M：2 000 bp DNA mar ker；1：LA MP產(chǎn)物酶切后Fig．10 Restriction fragments from LAMP products M：2 000 bp DNA mar ker；1：The LA MP pr oducts after restriction digestion

圖11 LAMP產(chǎn)物的不同鑒定方法A：直接觀察濁度；B：離心后觀察沉淀；C：添加染料后直接觀察；D：添加染料后紫外成像觀察Fig．11 The different methods for accrediting the LAMP products A：Direct obser vation on the t ur bidity；B：Direct observation after centrif uging；C：Direct observation after staining；D：Direct observation by UV after staining．

2．7 LA MP產(chǎn)物的檢測(cè)方法比較結(jié)果

2．7．1 LA MP產(chǎn)物直接電泳，該方法靈敏度高，但需電泳設(shè)備，且消耗一定的時(shí)間。

2．7．2 可見(jiàn)光下直接觀察濁度，陽(yáng)性和陰性的濁度不易區(qū)分，只有當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)物量大時(shí)才易區(qū)分，見(jiàn)圖11 A。

2．7．3 擴(kuò)增產(chǎn)物在3 000 r／min離心2 min，觀察沉淀，陽(yáng)性反應(yīng)管中觀察到有白色沉淀附著在反應(yīng)管底部，而且較清晰；陰性未見(jiàn)，見(jiàn)圖11B；

2．7．4 在LA MP反應(yīng)后在管中添加SYBR Green I顯色后直接光觀察，看到陽(yáng)性（亮綠色）和陰性（橙色）對(duì)比鮮明，這種顯色可以在數(shù)秒內(nèi)完成，見(jiàn)圖11C。

2．7．5 LA MP擴(kuò)增產(chǎn)物添加SYBR Green I顯色后紫外成像觀察，陽(yáng)性樣品產(chǎn)物呈現(xiàn)了較亮熒光，陰性則較暗，此法需紫外成像儀或紫外燈見(jiàn)圖11D。通過(guò)這幾種檢測(cè)方法的比較，作者認(rèn)為凝膠電泳、反應(yīng)產(chǎn)物離心后觀察沉淀和紫外成像更適合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而添加染料后直接觀察比較適合臨床快速檢測(cè)。

3 討 論

本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了環(huán)引物，使反應(yīng)時(shí)間大大縮短，建立了快速檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)的LA MP檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，該方法可以對(duì)DNA樣品實(shí)現(xiàn)20 min內(nèi)檢測(cè)，LA MP的檢測(cè)限度是5×100個(gè)卵囊／μL，和Karanis等［14］的報(bào)道相一致，但又比Ino mata等［15］報(bào)道的RT－LA MP低一些，考慮可能是擴(kuò)增位點(diǎn)不同及定量方法不同的影響；LA MP檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)的靈敏度比常規(guī)PCR高100倍，100倍靈敏度的差異和Iseki等［16］報(bào)道的一致，但比 Karanis等［14］報(bào)道的差異小。凝膠電泳、反應(yīng)產(chǎn)物離心后觀察沉淀和紫外成像觀察適合實(shí)驗(yàn)室使用，而添加染料直接觀察更適合臨床或野外條件下判讀結(jié)果。

LAMP經(jīng)過(guò)近十幾年的發(fā)展，在分子檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速，它操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可直接判斷，這些優(yōu)勢(shì)使其成為臨床疾病快速檢測(cè)的佼佼者。但也遇到一些問(wèn)題：該方法靈敏性高容易產(chǎn)生污染，這主要是針對(duì)LA MP產(chǎn)物開(kāi)蓋判斷結(jié)果來(lái)說(shuō)的，適當(dāng)?shù)闹甘緞┛梢越鉀Q這個(gè)問(wèn)題，隨著研究的深入，一些研究者設(shè)計(jì)了巧妙的方法改善和提高LAMP方法的實(shí)用性。Tao等［17］介紹了一種獨(dú)特的方法來(lái)指示LA MP結(jié)果，選用的染料為SYBR Green I，其先將一定量染料加到特制的蠟丸（熔點(diǎn)85℃）內(nèi)，在反應(yīng)前把蠟丸放入反應(yīng)管里，反應(yīng)過(guò)程中蠟丸不會(huì)溶解，反應(yīng)后把反應(yīng)管加熱到85℃，蠟丸溶解，同時(shí)染料與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸，這樣既解決了染料提前加入抑制擴(kuò)增反應(yīng)的問(wèn)題，又解決了反應(yīng)后開(kāi)蓋加染料容易污染的問(wèn)題。蠟丸的使用是一個(gè)進(jìn)步，但這樣增加了成本且多了一步加熱過(guò)程，它還有改進(jìn)的地方，我們可以借鑒使用蠟丸的經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)更巧妙的方法。Hatano等［18］報(bào)道了在一種便攜保溫袋中進(jìn)行LA MP擴(kuò)增，結(jié)果非?？煽?，這種保溫袋可在30 min內(nèi)從初始溫度（環(huán)境溫度）達(dá)到60℃，并可在60℃持續(xù)90 min。這種保溫袋是一次性使用的，它可以在4℃～37℃的外界溫度中穩(wěn)定工作，如果把它放到一個(gè)泡沫塑料盒內(nèi)，效果更好，而且它們花費(fèi)較低。其研究中，分別用保溫袋和常規(guī)加熱裝置進(jìn)行LA MP檢測(cè)，其檢測(cè)限度差異不明顯。這種保溫袋不需要電力就可以工作，在一些不發(fā)達(dá)或電力不充足地區(qū)的進(jìn)行疾病檢測(cè)非常實(shí)用，而且移動(dòng)性、限時(shí)性很強(qiáng)。

LAMP的優(yōu)勢(shì)就在于快速、簡(jiǎn)便，該方法的成功應(yīng)用受以下幾個(gè)因素的影響：第一，高效、特異的指示劑對(duì)于LA MP的結(jié)果判斷尤其重要，目前報(bào)道的指示劑染料有SYBR Green I、溴化乙錠、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)等［19－21］，基本上可以滿足非凝膠電泳方法的結(jié)果判斷；第二，影響LA MP結(jié)果的關(guān)鍵因子是引物的設(shè)計(jì)和選擇，對(duì)于未驗(yàn)證過(guò)的病原種類(lèi)檢測(cè)，引物應(yīng)驗(yàn)證后才能使用；第三，DNA的快速提取可為L(zhǎng)A MP方法檢測(cè)的過(guò)程節(jié)省時(shí)間，因此快速、簡(jiǎn)單的DNA提取方法也是LA MP臨床快速檢測(cè)應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵因子，目前細(xì)菌方面通過(guò)加熱和離心基本可實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便地提取DNA。隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，LA MP在疾病現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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