轉Bar基因稻谷對小鼠肝功能若干參數的影響

段妍慧，富麗娜，黃 毅，孫艷波，劉 金，顏亨梅

（湖南師范大學生命科學學院動物生態(tài)研究室，湖南 長沙 410081）

國際上第一批轉基因抗除草劑作物美國耐溴苯腈棉花和加拿大耐草丁膦油菜于1995年上市后，各國利用不同的抗除草劑基因培育了不同的抗除草劑作物。隨著轉基因作物的迅速發(fā)展，人們對其安全性的思考也逐漸加深。轉抗除草劑基因稻谷在農業(yè)上給人類帶來較大的益處，但從可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，還需要對其生物安全性進行全面評價，以確保自然界平衡及人類食品安全。其中，針對轉Bar 基因稻谷，已有專家從群落和基因方面對其做出了分析評價，認為該稻谷對細菌、昆蟲等在群落結構上未產生明顯影響[1-3]，但作為人類的主食，轉Bar 基因稻谷的安全性還需要用與人類更為接近的哺乳動物進行進一步的檢測。與轉Bt 毒蛋白稻谷不同，轉抗除草劑基因產物的靶目標一般是人工合成的除草劑，自然界中極少存在于其結構相似的物質，許多試驗中均證明抗除草劑基因對生物體沒有急性毒性[4]。但由于轉基因植物中含有的轉基因量相對較少，且生物有一定的適應性，因此短時間喂養(yǎng)[5-7]或者直接灌喂轉基因蛋白[8]的方法不能反映出轉基因植物對小鼠世代累積的影響。筆者通過喂養(yǎng)親本小鼠90 d，對其繁殖的F1、F2代小鼠進行生化指標的檢測，對實驗室條件下轉基因水稻對傳代小鼠肝功能的影響進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試稻谷為轉基因抗除草劑恢復系Bar 68-1、雜交早稻組合香125S/Bar68-1 和對照香兩優(yōu)68（香125S/D68），由中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所提供；供試哺乳動物為SPF 級昆明小鼠，6 周齡大小的小鼠120 只，體重分布范圍18～20 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計 在保證小鼠正常生命活動不受影響（主要考慮蛋白質的攝入量）的情況下，配比小鼠食物的成分。按照GBl5193.1-2003《食品安全性毒理學評價程序》[9]規(guī)定，最高劑量組是不影響膳食平衡的最大添加量。選擇18～20 g 區(qū)間的昆明小鼠120 只，隨機平均分為6 組，其中3 組分別喂食含量為20%（A）、40%（B）、60%（C）的轉Bar 基因稻谷，另外3 組以同品系常規(guī)稻谷飼喂作為對照，分別喂食含量為20%（CKA）、40%（CKB）、60%（CKC）的常規(guī)基因稻谷。采取自由取食取水方式喂養(yǎng)，雌雄分籠喂養(yǎng)90 d。用相對應組別親本小鼠合籠，產下F1代，飼養(yǎng)至性成熟后，隨機每組抽取5 只進行檢測。同方法繁殖F2代，飼養(yǎng)至性成熟后，隨機每組抽取5 只進行檢測。處死前12 h 禁食。

1.2.2 觀測內容及測定指標 （1）觀察各組小鼠日常行為，記錄是否出現異常行為。（2）采樣及血生化指標測定：隨機取每組小鼠，摘眼球采血，取1.5 mL 血于離心管中呈斜面放置30 min，4 500 g 離心15 min，制備血清。用全自動生化分析儀檢測，測定白/球比（A/G）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH-L）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）8項指標。（3）肝臟器官指數測定：每組隨機抽取5 只空腹小鼠，抽血樣后，取肝臟拭去表面污血，用天平（10-4g）稱重。器官指數=器官重量/體重。

1.2.3 數據處理 運用數據軟件SPSS13.0 對數據進行獨立樣本t 檢驗，P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計結果均用“均數±標準差（Means±SD）”表示。

2 結果與分析

2.1 對傳代小鼠行為的影響

通過持續(xù)性觀察，每天按時跟蹤觀察和記錄兩代小鼠日常行為，尤其在下午13∶00～14∶00 時間段內進行仔細觀察，兩代小鼠均未發(fā)現異?，F象。每天分別在早上8∶30～9∶00，晚上19∶30～20∶00 喂食后，觀察小鼠攝食、飲水情況，均積極攝食、飲水，并未發(fā)現精神不振，厭食等現象。轉基因組和常規(guī)對照組F1、F2兩代小鼠均未出現異常行為。因此，轉基因稻谷對傳代小鼠的日常行為未產生明顯影響。

2.2 對傳代小鼠肝功能的影響

2.2.1 小鼠肝臟器官指數測定 如表1 所示，與對照相比，F1、F2代A、B、C 3 個劑量組小鼠肝臟器官指數均無明顯差異（P>0.05）。

表1 供試小鼠肝臟器官指數測定

2.2.2 小鼠肝臟細胞生化指標測定 如表2 所示，對小鼠肝臟細胞損傷代謝能力生化指標進行測定，與對照相比，F1除B 組堿性磷酸酶出現顯著性差異（P=0.017<0.05）外，A、C 組的白/球比、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶等指標均無顯著性差異（P>0.05）；F1代A、B、C 3 組的葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇3 項指標均無顯著性差異（P>0.05）。

對F2代小鼠肝臟細胞損傷代謝能力生化指標進行了測定，結果見表3，與對照相比，F2代A、B、C 3 組的白/球比、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶5 項指標均無顯著性差異（P>0.05）；F2代A、B、C 3 組的葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇3 項指標均無顯著性差異（P>0.05）。

表2 F1 代供試小鼠肝臟生化指標測定

表3 F2 代供試小鼠生化指標的測定

3 小結與討論

通過對動物的行為進行觀察，可以了解動物的身體以及生活狀況。動物的行為是個體與其內外環(huán)境維持動態(tài)平衡的重要表現形式。當動物受到外界刺激時，將會產生某些異常行為。動物的異常行為主要表現如下：以固定形式反復出現的行為，并沒有明確的生物學功能；嗜血；攻擊性加強；生殖方面失常，主要為性行為失?；蛉狈δ感?。有資料報道，供試的昆明小鼠在下午13∶00～14∶00 是皮質醇分泌高峰期，小鼠高度興奮，這也是異常行為發(fā)生較多的時間段。另外，小鼠的攝食、飲水情況，可以反映出小鼠身體狀況，當小鼠身體產生病變時，小鼠會出現厭食、精神萎靡等現象。兩代小鼠在試驗條件下均未發(fā)現異?，F象，由此可見，用轉Bar 基因稻谷喂養(yǎng)并未對小鼠日常行為產生明顯影響。

器官指數是指試驗動物某臟器的重量與其體重之比值。正常成年動物的器官重量會隨著體重的增長而增加，在不同時期各器官增重的幅度不同，但兩者之間的正相關性不會改變。動物染毒后，受損臟器重量可以發(fā)生改變，故臟器系數也隨之而改變。動物體發(fā)生病變時，物質代謝得不到有效調節(jié)而不能正常進行，血液中某些化學物質及其代謝產物的含量就會發(fā)生改變。因此，人們一直將這一特性用于藥物安全評價的長期毒性試驗及其他較長時間觀察動物臟器受影響與否的試驗。肝臟作為“物質代謝中樞”對全身物質代謝和生理機能有著重大影響，肝臟功能受損對機體會產生嚴重的危害。試驗通過解剖觀察小鼠肝臟形態(tài)及結構，未發(fā)現明顯硬化、腫大、萎縮等病理變化。結果表明：兩代轉基因組與常規(guī)對照組小鼠肝臟器官指數并無顯著性差異（P>0.05）。由此可見，轉基因稻谷對小鼠肝臟器官指數無明顯影響。

機體各組織細胞都有合成蛋白質的能力，其中以肝細胞最強。肝臟除了合成本身所需要的各種蛋白質外，還能合成大部分血漿蛋白。肝臟出現病理變化時，血漿蛋白尤其是白蛋白含量降低，同時肝病變的各種因素又刺激巨噬細胞系統(tǒng)合成球蛋白增多，故A/G 值下降。因此，通過A/G 值的比較，可以了解肝臟是否發(fā)生病變[10]。谷丙轉氨酶主要存在于肝細胞漿內，其細胞內濃度遠遠高于血清中濃度，只要有1%的肝細胞壞死，就可以使血清中該酶含量增高1 倍。因此，谷丙轉氨酶被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。谷草轉氨酶主要存在于肝臟細胞線粒體內，當肝臟發(fā)生嚴重壞死或破壞時，才能引起谷草轉氨酶在血清中濃度偏高。試驗將2 種轉氨酶共同作為判斷肝臟病變的主要指標，根據白/球比、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶等主要肝功能細胞損傷生化指標值來看，轉基因組和常規(guī)對照組的兩代小鼠中以上3 項指標均無顯著性差異。

堿性磷酸酶除存在于肝臟外，還廣泛分布于腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織中，是診斷骨病、黃疸肝炎等疾病的依據[11]。乳酸脫氫酶主要用于心肌梗塞、腫瘤、肝病等診斷[11]。在F1代B 組中，盡管與對照相比，堿性磷酸酶的差異達到了顯著水平，但是轉基因水稻組各組之間數值不存在明顯差異，常規(guī)對照組同樣也無明顯差異。這2 項指標用于檢測的范圍甚廣，但與試驗要檢測的生理生化指標關聯性不強，因此筆者將其作為檢測轉基因稻谷對小鼠肝功能影響的輔助指標。堿性磷酸酶的變化與其他生理現象也有密切關系，出現差異可能是由其他生理活動造成，這有待今后進一步研究。

血清中血糖的濃度代表了肝的糖生成能力，血糖直接氧化供給動物機體代謝活動所需能量，血糖的含量變化是機體對糖的吸收、轉運和代謝的動態(tài)平衡狀態(tài)的反應。正常動物的血糖水平一般相對穩(wěn)定。甘油三酯和膽固醇是血脂檢測中最重要的2 項指標，其含量是衡量動物健康的重要標志。該試驗結果表明，血糖、甘油三酯和總膽固醇各組間差異均不顯著。這表明與常規(guī)水稻飼喂相比，轉基因稻谷喂養(yǎng)小鼠對其肝臟代謝影響不顯著。

綜合了解轉基因稻谷是否會對小鼠造成影響，較單一的指標更有參考價值。因此，在綜合考慮供試小鼠的日常行為、肝臟器官指數、肝臟細胞損傷生化指標、肝臟代謝水平生化指標等測定結果的基礎上，筆者認為在該試驗條件下，與非轉基因稻谷喂養(yǎng)小鼠相比，轉Bar 基因稻谷飼喂未發(fā)現對小鼠肝功能造成明顯的影響。

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