紫斑牡丹胚培養(yǎng)及幼苗生長的研究

王 瑩，何桂梅，韓麗曉

（1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.北京市林業(yè)碳匯工作辦公室，北京 100013）

紫斑牡丹（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Li）是中國牡丹家族中的重要成員之一，以其作為主要遺傳種質(zhì)演化形成的西北（紫斑）牡丹品種群是目前中國牡丹中僅次于中原牡丹的第二大品種群[1]。紫斑牡丹植株長勢強盛、開花繁茂、花頭直立，具有抗寒、耐旱、抗病和耐瘠薄等優(yōu)良特性[2]，是我國牡丹育種和遺傳改良極為珍貴的野生種質(zhì)資源。自然栽培條件下紫斑牡丹屬于專性有性繁殖[3]，由于種子具有典型的上胚軸休眠現(xiàn)象導(dǎo)致其發(fā)芽率極低，幼苗質(zhì)量不穩(wěn)定[4]，在很大程度上制約了牡丹的繁殖及育種工作。

胚培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已在植物遠緣雜交、克服頑拗種子休眠及發(fā)育生物學(xué)等研究方面得以廣泛應(yīng)用，對提高種子萌發(fā)率、縮短萌發(fā)時間、及時進行雜種胚拯救、加速育種進程都有重要意義[5]。目前，牡丹胚培養(yǎng)研究主要包括不同基因型離體胚培養(yǎng)、叢生苗誘導(dǎo)及植株再生、生長調(diào)節(jié)劑對離體胚萌發(fā)及生長的影響[6-12]，而這些研究都沒能建立高效穩(wěn)定的成苗體系，紫斑牡丹的胚培養(yǎng)也鮮有報道。筆者先研究紫斑牡丹胚離體生長與成苗過程中的影響因素，確定適宜的培養(yǎng)基；再選擇不同成熟度的種胚通過不同外植體類型進行試驗，摸索出紫斑牡丹胚培養(yǎng)最適宜的采種時間以及外植體類型，旨在建立穩(wěn)定的紫斑牡丹胚培養(yǎng)體系，并為胚培養(yǎng)技術(shù)輔助遠緣雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以紫斑牡丹（P.rockii hybrid）自然授粉花后約90 d 與120 d 的紫斑牡丹種子為試驗材料（從北京林學(xué)會基地的健壯植株上采得）。外植體分為離體胚和帶胚乳兩種。試驗在北京林業(yè)大學(xué)科研樓組培室進行，培養(yǎng)條件：溫度20～25℃，光照強度為2 000～3 000 Lx，光照時間12 h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒與接種 種子剝出后用洗滌靈溶液將其表面漂洗干凈，流水沖洗30 min 后置于超凈工作臺上。用70%酒精與10% 84 消毒液分別消毒種子3 min 與15 min。各次消毒后均用無菌水沖洗3次，每次浸泡3 min。接種于不同啟動培養(yǎng)基上，每瓶（100 mL）接種3 個，3 瓶為一個處理，重復(fù)3 次。

1.2.2 啟動培養(yǎng)基篩選 以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的PGRs（Plant growth regulators—植物生長調(diào)節(jié)劑），接種后35 d 調(diào)查種胚的萌發(fā)生長效果，篩選出最佳的啟動培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上以1/2 MS+最適PGRs 為啟動培養(yǎng)基。每周定期觀察啟動生長表現(xiàn)，繼代周期35 d。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基篩選 以1/2 MS+0.05% AC 為基本繼代培養(yǎng)基，附加不同濃度的IBA，將接種于附加不同濃度的PGRs 啟動培養(yǎng)基上的幼苗進行繼代，觀察繼代生長表現(xiàn)，從而篩選出最佳繼代培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上以1/2 MS+0.05% AC+最適IBA為繼代培養(yǎng)基，分別將生長于1/2 MS+最適PGRs啟動培養(yǎng)基上的幼苗進行繼代，每周定期觀察繼代生長表現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對紫斑牡丹種胚啟動生長的影響

以1/2 MS 為基本啟動培養(yǎng)基，通過PGRs 的不同種類及濃度的組合進行了啟動培養(yǎng)基的篩選，發(fā)現(xiàn)PGRs 的應(yīng)用使得各培養(yǎng)基上幼胚的胚軸普遍膨大，部分長出大量的愈傷組織（表1）。其中在3號培養(yǎng)基中胚軸膨大率最高為100%，胚軸膨大率較高的3、6、7、8 號與其他培養(yǎng)基的差異顯著，胚軸膨大率較低的1、2、10 號三者之間沒有顯著差異，說明單一低濃度的BAP（0.5 mg/L）與GA3（0.5 mg/L）對胚軸的刺激作用不明顯，二者與低濃度IBA（0.25 mg/L）混合使用也有相似效果。在9 號和7 號培養(yǎng)基中抽腋芽或分化葉狀體率最高，除與1 號和6 號差異不顯著外，與其他培養(yǎng)基均有顯著差異。而在成苗率上5 號培養(yǎng)基為最高，與其余培養(yǎng)基差異顯著。綜合認為，1/2 MS+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L GA3（5 號培養(yǎng)基）為最適宜成苗的啟動培養(yǎng)基。

表1 培養(yǎng)基對紫斑牡丹種胚啟動生長的影響（35 d）

2.2 不同培養(yǎng)基對紫斑牡丹種胚繼代生長的影響

幼苗用3 水平的IBA（0.1、0.2、0.4 mg/L）進行10～15 d 短期根誘導(dǎo)后再繼代至不含PGRs 的培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)85 d 統(tǒng)計結(jié)果（表2）。發(fā)現(xiàn)僅4 號的生根率及成苗率與其他的差異顯著，說明對于胚培養(yǎng)苗的繼代生長而言，不含PGRs 的1/2MS 培養(yǎng)基已經(jīng)可以達到較好的效果，成苗率均可達到50%。另外發(fā)現(xiàn)IBA 根誘導(dǎo)處理后，低濃度的IBA（0.1、0.2 mg/L）對幼苗生長差異不顯著，高濃度的IBA（0.4 mg/L）反而抑制幼苗的生長。其中0.1 mg/L IBA 對幼苗的葉片數(shù)、生根率及成苗率等都有一定程度的提高，因此1/2 MS+0.05%AC+0.1 mg/L IBA為根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基，1/2 MS+0.05% AC 為繼代生長最佳培養(yǎng)基。

2.3 紫斑牡丹采種時間及外植體類型對啟動生長的影響

以1/2MS+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L GA3為培養(yǎng)基，分別選擇紫斑牡丹花后90 d 和120 d 采收種子，按外植體類型分為離體胚和去種皮帶全部胚乳。研究表明（表3），從胚軸膨大率上可以看出，不論采收時間為何時，外植體為全部胚乳的表現(xiàn)明顯好于離體胚，并且它們之間差異顯著；從抽真葉率和抽莖率上可以看出，花后120 d 全部胚乳的處理最好，與其他處理間差異顯著；而從葉柄長可以看出，花后90 d 離體胚的處理最好，與其他處理間差異顯著。說明以全部胚乳為外植體對胚軸的膨大生長有一定作用，花后120 d 采收有助于種子的抽真葉與抽莖生長，而對于葉柄生長則以花后90 d 的離體胚處理效果最好。

表2 培養(yǎng)基對紫斑牡丹種胚繼代生長的影響（85 d）

2.4 紫斑牡丹采種時間及外植體類型對繼代生長的影響

表3 紫斑牡丹的不同處理在啟動培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)（30 d）

將啟動培養(yǎng)基中的幼苗以1/2 MS+0.05% AC+0.1 mg/L IBA 為根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行短期培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入1/2 MS+0.05% AC 的繼代生長培養(yǎng)基中。從啟動培養(yǎng)到繼代培養(yǎng)共85 d，結(jié)果表明（表4），從抽真葉率和抽莖率上可以看出不論采收時間為何時，外植體為全部胚乳的表現(xiàn)好于離體胚，并且差異顯著；從葉柄長和莖長可以看出花后90 d 離體胚的處理生長要好于其他處理，并且在莖長上有顯著性差異。說明由于外植體類型的不同，會導(dǎo)致植株生長在不同指標上表現(xiàn)出差異性。帶全部胚乳的接種方式對抽真葉、抽莖等萌發(fā)生長有利，而離體胚的接種方式則對莖長、葉柄長等伸長生長有利。

表4 紫斑牡丹的不同處理在繼代培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)（85 d）

2.5 不同處理對紫斑牡丹胚培養(yǎng)幼苗生長的顯著性分析

在啟動培養(yǎng)階段（表5），研究發(fā)現(xiàn)采種時間的不同對真葉片數(shù)、抽莖率、葉柄長有顯著影響，其中對抽莖率有極顯著影響；外植體類型對抽真葉率、胚軸膨大率、葉柄長有顯著影響；其中對胚軸膨大率和葉柄長均有極顯著影響；而采種時間*接種方式兩者間的交互效應(yīng)均對胚軸膨大率與葉柄長有顯著影響，其中對葉柄長有極顯著影響。

表5 紫斑牡丹的不同處理在啟動培養(yǎng)基中的生長顯著性分析（30 d）

在繼代生長階段（表6），采種時間的不同對真葉片數(shù)、葉柄長、莖長有顯著影響，其中對葉柄長有極顯著影響；外植體類型對抽真葉率及抽莖率有極顯著影響；而采種時間*接種方式兩者間的交互效應(yīng)僅對莖長有顯著影響。

表6 紫斑牡丹的不同處理在繼代培養(yǎng)基中的生長顯著性分析（85 d）

綜合認為在紫斑牡丹胚培養(yǎng)過程中，種子的采收時間對真葉片數(shù)、葉柄長、莖長等指標影響顯著，說明種子成熟度的不同會影響幼苗的伸長生長；外植體類型對抽莖率、抽真葉率、胚軸膨大率等指標影響顯著，說明胚乳存在與否直接影響種子的萌發(fā)情況。

3 討 論

紫斑牡丹胚培養(yǎng)研究的目標是獲得高質(zhì)量幼苗，而種胚能否正常啟動與啟動培養(yǎng)基的成分密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的PGRs，其中單獨使用BAP 可促進胚子葉增大、胚軸增粗，這與曹小勇[12]的觀察結(jié)果相似。GA3能解除部分胚軸的休眠，促進莖的伸長，單獨使用效果同BAP 相似，這與Buchheim[13]對芍藥的研究結(jié)果相符合。IAA 與GA31∶1 配合時抽真葉率、生根率及成苗率都較高，因此篩選出最適宜種胚啟動生長的培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L GA3。

目前牡丹組培快繁技術(shù)無法應(yīng)用于生產(chǎn)的瓶頸主要在于組培苗生根困難，影響生根的因素主要包括前一次的繼代時間、生根芽的類型及生根方法等[14]。對幼苗短期的根誘導(dǎo)處理發(fā)現(xiàn)，IBA 的濃度直接影響幼苗的繼代生長情況，低濃度IBA（0.1 mg/L）可以促進幼苗生長，高濃度的IBA（0.4 mg/L）反而抑制幼苗生長，最適宜的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+0.05%AC+0.1 mg/L IBA。研究還發(fā)現(xiàn)PGRs 對幼苗發(fā)育具有明顯的致畸作用，因此對于生根后幼苗生長的培養(yǎng)基選擇不含PGRs 的1/2 MS+0.05%AC。

紫斑牡丹為專性有性繁殖，實生苗一般需要3～5 a 才能開花，而從雜交授粉到一個優(yōu)質(zhì)新品種的選育過程至少需要10 a 以上的時間。在此過程中，由于種子具有上胚軸休眠特性，因此自然條件下其成熟與萌發(fā)也需要較長時間，并且萌發(fā)率與成苗率都不高，很難獲得整齊一致的幼苗。本研究在已篩選出最適宜培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，試圖通過種子成熟度以及外植體類型來找到既能使種子快速萌發(fā)又能提高成苗質(zhì)量的有效途徑。雖然帶全部胚乳的種子在生長上沒有離體胚啟動快[15]，但是當全部胚乳接種長出胚根后，及時去掉胚乳再接回原培養(yǎng)基中，幼苗生長質(zhì)量要優(yōu)于離體胚的生長。由于紫斑牡丹胚乳中含有較高的還原糖及脂肪，為胚休眠、萌發(fā)提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[16]，種子萌發(fā)也具有明顯的階段性，在萌發(fā)過程中，需要胚乳提供營養(yǎng)，一旦胚乳完成此功能需及時去掉，否則會抑制幼苗生長。種子采收時間的不同，直接影響種子的成熟度，這就與胚乳提供營養(yǎng)的情況密切相關(guān)，目前關(guān)于還原糖、淀粉、粗脂肪可能在種子各個萌發(fā)階段中的作用還不是很清楚，尚待進一步研究。

研究設(shè)計從啟動培養(yǎng)到繼代生長共85 d，獲得的幼苗絕大多數(shù)具有多片真葉及抽莖或已生根，提前了發(fā)育時期，縮短了種子的萌發(fā)期。因此，一個可靠的快繁體系可能克服牡丹在繁殖及育種方面的問題[17]，如果能將胚培養(yǎng)技術(shù)與牡丹遠緣雜交育種相結(jié)合，一定會大大縮短育種周期，提高育種效率，從而加快牡丹育種進程。

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