結(jié)晶法純化2′-脫氧腺苷的工藝研究

趙 洪 娥, 崔 勵

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

2′-脫氧腺苷是一種天然的脫氧核苷,是脫氧核糖核酸DNA的結(jié)構(gòu)片段,是基因藥物和基因工程研究的重要原材料,具有很好的生理活性,經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的2′-脫氧腺苷類似物具有良好的抗腫瘤活性,因此在市場上有廣泛需求[1-2]。2′-脫氧腺苷可通過脫氧核糖核酸的降解而得到,但是由于DNA供應(yīng)的不穩(wěn)定,以及降解后產(chǎn)物分離困難等原因,使得該方法并不實(shí)用。2′-脫氧腺苷也可通過化學(xué)合成法合成,但其步驟過于復(fù)雜[3],比如一些基團(tuán)的保護(hù)與去保護(hù)以及糖基的活化等[4]。通過生物轉(zhuǎn)化法合成2′-脫氧腺苷,具有步驟簡單等優(yōu)點(diǎn),避免了以上不足。本實(shí)驗(yàn)的原料為2′-脫氧腺苷的生物轉(zhuǎn)化液,其主要成分有核糖基供體2′-脫氧胸苷、堿基供體腺嘌呤、副產(chǎn)物胸腺嘧啶和主產(chǎn)物2′-脫氧腺苷[5-6]。

目前國內(nèi)外學(xué)者對提高2′-脫氧腺苷轉(zhuǎn)化率的研究較多[6-7],有關(guān)提取純化工藝的文獻(xiàn)報(bào)道卻很少。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)晶法對生物轉(zhuǎn)化液中的2′-脫氧腺苷進(jìn)行分離純化、富集,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙醇、碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、標(biāo)準(zhǔn)品2′-脫氧腺苷,均為分析純；甲醇,色譜純；2′-脫氧腺苷生物轉(zhuǎn)化液,實(shí)驗(yàn)室自制。

島津高效液相色譜儀,UV檢測器(SPD-10A),C18反相柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2′-脫氧腺苷的分離、純化

預(yù)處理:將實(shí)驗(yàn)室制得的生物轉(zhuǎn)化液離心(室溫,4 200 r/min,10 min)除去菌體,得到上清液,其中2′-脫氧腺苷的質(zhì)量濃度為10.5 g/L,腺嘌呤質(zhì)量濃度2.3 g/L,胸腺嘧啶質(zhì)量濃度3.1 g/L,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將預(yù)處理得到的生物轉(zhuǎn)化液調(diào)至一定pH范圍內(nèi),冷卻靜置一段時間分離雜質(zhì)堿基,抽濾分離析出的固體,60 ℃烘干稱重。

將除去大量堿基后的生物轉(zhuǎn)化液進(jìn)行濃縮,然后在堿性范圍內(nèi)調(diào)節(jié)pH,冷卻靜置一段時間,抽濾得2′-脫氧腺苷粗品。

以乙醇溶液為溶劑,于60 ℃制成2′-脫氧腺苷的飽和溶液,4 ℃靜置重結(jié)晶。

1.2.2 HPLC檢測分析

2′-脫氧腺苷、2′-脫氧胸苷、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)的質(zhì)量濃度采用HPLC測定[7],流動相:pH 6.0的5 mmol/L磷酸鹽緩沖液與甲醇的體積比為85∶15；吸收波長,254 nm；體積流量,0.8 mL/min。吸取0.5 g/L 2′-脫氧腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0、8.0、6.0、4.0、2.0 mL,分別加去離子水稀釋至10.0 mL,測定它們的吸光度值,得2′-脫氧腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線:

y=0.035 7xR2=0.999 6

式中,x為dA峰面積×10-3；y為dA的質(zhì)量濃度(mg/L)。

胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法同2′-脫氧腺苷,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:

y=0.063 2xR2=0.999 1

式中,x為T峰面積×10-3；y為T的質(zhì)量濃度(mg/L)。

y=0.059 1xR2=0.999 3

式中,x為A峰面積×10-3；y為A的質(zhì)量濃度(mg/L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離堿基pH的確定

用1.0 mol/L的NaOH、HCl溶液分別調(diào)節(jié)生物轉(zhuǎn)化液的pH,考察pH對分離堿基的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可以看,當(dāng)pH為7.0時,堿基析出率達(dá)最高值,且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2′-脫氧腺苷損失低于2%,由此確定堿基的最佳析出pH為7.0。

圖1 pH對堿基析出率的影響

2.2 分離堿基冷卻時間的確定

由圖2可以看出,在冷卻時間24 h內(nèi),隨著時間的增加,堿基的析出率增加明顯,當(dāng)冷卻時間超過24 h后,堿基析出率幾乎不再增加。由此可確定,分離堿基適宜的冷卻時間為24 h。

圖2 冷卻時間對分離堿基的影響

2.3 2′-脫氧腺苷結(jié)晶pH的確定

將分離部分堿基后生物轉(zhuǎn)化液調(diào)至堿性范圍內(nèi),使2′-脫氧腺苷在其等電點(diǎn)附近析出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 pH對2′-脫氧腺苷結(jié)晶的影響

由圖3可知,當(dāng)pH為10.0、10.5時,2′-脫氧腺苷的析出率和純度均相差不多,綜合考慮,確定2′-脫氧腺苷結(jié)晶的適宜pH為10.0。

2.4 生物轉(zhuǎn)化液質(zhì)量濃度的確定

濃縮生物轉(zhuǎn)化液以調(diào)節(jié)2′-脫氧腺苷在生物轉(zhuǎn)化液中的質(zhì)量濃度，使其處于較高的質(zhì)量濃度，且堿基的質(zhì)量濃度較低，以便得到純度和收率均較高的2′-脫氧腺苷晶體。

由圖4可知,隨著生物轉(zhuǎn)化液有效物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加,2′-脫氧腺苷收率增加,但純度有所下降。綜合考慮2′-脫氧腺苷收率、純度和生產(chǎn)耗能量,生物轉(zhuǎn)化液濃縮至2′-脫氧腺苷的質(zhì)量濃度為 50 g/L時進(jìn)行結(jié)晶較適宜。

圖4 生物轉(zhuǎn)化液質(zhì)量濃度對2′-脫氧腺苷結(jié)晶的影響

Fig.4 Effect of the concentration on dA crystallization

2.5 2′-脫氧腺苷結(jié)晶時間的確定

由圖5可見,隨著結(jié)晶時間的增加,粗品中2′-脫氧腺苷的收率稍有增加,但純度卻有所降低,綜合考慮結(jié)晶純度與收率,最終結(jié)晶時間確定為6 h,結(jié)晶得到的2′-脫氧腺苷收率和純度均較高。

圖5 結(jié)晶時間對2′-脫氧腺苷析出的影響

2.6 2′-脫氧腺苷粗品的重結(jié)晶

以體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇為溶劑,制成2′-脫氧腺苷質(zhì)量濃度為52.0 g/L的溶液,4 ℃進(jìn)行重結(jié)晶。產(chǎn)品總收率可達(dá)62%,純度≥99%,產(chǎn)品HPLC圖譜如圖6。

圖6 重結(jié)晶產(chǎn)品的HPLC圖

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)采用結(jié)晶法分離純化生物轉(zhuǎn)化液中的2′-脫氧腺苷,得到的最佳工藝為:除雜質(zhì)堿基適宜的pH為7.0,時間24 h；原液經(jīng)濃縮至有效物質(zhì)量濃度為50.0 g/L；2′-脫氧腺苷粗品的結(jié)晶pH為10.0,時間6 h,以體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶,純品總收率達(dá)62%,利用高效液相色譜法檢測2′-脫氧腺苷,純度99%。該法較之其他方法如柱層析法簡便易行、成本低,易于工業(yè)化。

[1] LIANG Shenghua, LI Wenzhou, GAO Tong, et al. Enzymatic synthesis of 2′-deoxyadenosine and 6-methylpurine-2′-deoxyriboside byEscherichiacoliDH5α overexpressing nucleoside phosphorylases fromEscherichiacoliBL21[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 110(2):165-168.

[2] 岳明,倪孟祥. 常用的核苷類化合物分離技術(shù)及應(yīng)用[J]. 藥學(xué)進(jìn)展, 2006, 30(10):442-447.

[3] GOYAL R N, DHAWAN A. Oxidation chemistry of 2′-deoxyadenosine at pyrolytic graphite electrode[J]. Bioelectrochemistry, 2006, 69(2):223-233.

[4] 蔣忠良,李乾坤,齊湘兵,等. 2′-脫氧腺苷全合成研究[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 35(9):1264-1268.

[5] KENZO Y, TAKASHI T. A novel enzymatic method for the production of purin-2′-deoxyribomuclosides[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2000, 10:207-213.

[6] 洪云海,丁慶豹,邱蔚然,等. 應(yīng)用乙酰短桿菌酶法合成2′-脫氧腺苷[J]. 工業(yè)微生物, 2006, 36(1):30-32.

[7] ZINCHENKO A I, BARAI V N, BOKUT S B, et al. Enzymatic synthesis of 2′-deoxyadenosine[J]. Biotechnology Letters, 1991, 13(2):87-90.