超聲波破碎法提取發(fā)酵性絲孢酵母胞內脂肪酶的條件優(yōu)化

王 迪, 曹 方, 欒 靜, 孫 玉 梅

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一類能在油水界面上催化長鏈甘油酯水解和合成的羧酸酯酶[1],被廣泛應用在油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等領域。微生物脂肪酶因其種類繁多,具有更廣的作用pH、作用溫度范圍等優(yōu)點得到了廣泛的研究和應用[2]。發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵產生的脂肪酶是胞內酶[3],細胞破碎是提取胞內脂肪酶的關鍵步驟,常用的破碎方法包括超聲波法、高壓勻漿法、研磨法和化學滲透法[4-7]。超聲波細胞破碎是一種效果理想、條件溫和的破碎方法,已廣泛應用于微生物和植物細胞內蛋白質、糖類、核苷、油脂和酶類等物質的提取[8-12]。然而,超聲波在細胞破碎過程中易引起特異性細胞壁的破壞、細胞液中高熱量以及有害自由基的生成[13]。因此,研究最佳超聲波提取條件對于最大限度的釋放細胞內的活性物質,同時減少其損失具有重要意義。發(fā)酵性絲孢酵母胞內脂肪酶的系統(tǒng)研究在國內尚未見報道。本文研究了超聲波的輸出功率、每次輻射時間、工作總時間、菌體質量濃度對發(fā)酵性絲孢酵母細胞破碎的影響,以獲得較高活性脂肪酶的適宜提取條件,為該脂肪酶的后續(xù)研究奠定基礎。

1 試 驗

1.1 菌 種

發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans),CICC 1368,購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.2 材料與儀器

78-1型磁力加熱攪拌器,江蘇金壇國華儀器廠；JYL-A010料理機,九陽股份有限公司；501型超級恒溫器,上海市上?？h試驗儀器廠。

1.3 方 法

1.3.1 培養(yǎng)基及其制備

固體斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母浸粉10,蛋白胨10,瓊脂20,pH自然。于0.1 MPa滅菌15 min。

液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100,蛋白胨5.3,酵母膏2,尿素2,MgSO40.5,pH自然。除尿素外的其他成分于0.08 MPa滅菌20 min,尿素在0.05 MPa滅菌15 min。

發(fā)酵產酶培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100,蛋白胨1.8,酵母膏0.5,KH2PO42,植物油8.5,吐溫80 4.6,pH自然。于0.08 MPa滅菌20 min。

1.3.2 培養(yǎng)方法

菌種活化:將4 ℃保存的酵母菌種接于固體斜面培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)48 h。

液體種子培養(yǎng):取兩環(huán)活化菌絲接入液體種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

菌體發(fā)酵產酶培養(yǎng):向發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中接入體積分數(shù)10%的液體種子,于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)60 h。

1.3.3 粗酶液的制備

將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集菌體,用10 mL 、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液離心洗滌菌體2次,稱取1 g菌體與25 mL、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液混合,于冰水浴中進行超聲波破碎,將細胞破碎液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集上清液,上清液即為粗酶液。

1.3.4 脂肪酶活力測定方法

采用橄欖油乳化液法定量測定[14]。取兩個100 mL三角瓶,分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中加入4 mL PVA橄欖油乳化液和5 mL、pH 6.8 的0.067 mol/L磷酸鹽緩沖液,再于A瓶中加入95% 乙醇15 mL,于38 ℃水浴中預熱5 min,然后于A、B瓶中各加入1 mL待測酶液,立即混勻,準確反應10 min,于B瓶中加15 mL 95% 乙醇終止反應。于空白和樣品溶液中各加兩滴酚酞指示劑,用0.01 mol/L NaOH溶液滴定水解產生的脂肪酸。

脂肪酶活力定義:在38 ℃、pH 6.8的反應條件下,將每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產生1 μmol 脂肪酸所需酶量定義為一個活力單位。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲波輸出功率對脂肪酶活性的影響

選擇超聲波每次輻射時間為5 s、間歇時間為5 s、工作總時間為5 min,研究超聲波輸出功率對脂肪酶活性的影響,結果見圖1。

圖1 超聲波輸出功率對脂肪酶活性的影響

Fig.1 The effect of ultrasound output power on the lipase activity

由圖1可見,脂肪酶活性隨輸出功率的增加先升高后降低。輸出功率過小,不能有效破壞細胞壁,釋放脂肪酶；增加輸出功率,有利于空化泡的形成,從而增強破碎作用,但是輸出功率過大,則會引起細胞液局部的溫度和壓力過高,降低脂肪酶的活性[15]。因此,選定超聲波破壁的輸出功率為500 W。

2.1.2 超聲波每次輻射時間對脂肪酶活性的影響

選擇超聲波輸出功率為500 W、間歇時間為5 s,工作總時間為5 min,研究超聲波每次輻射時間對脂肪酶活性的影響,結果見圖2。由圖2可知,脂肪酶活性隨每次輻射時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,每次輻射時間為6 s的脂肪酶活力最高。超聲波的空化效應需要有足夠的時間和更多的機會來完成,故短時多次的工作方式更有利于細胞破碎。每次輻射時間高于6 s,隨著輻射時間的延長、輻射次數(shù)的減少脂肪酶活性降低。不過,每次輻射時間低于6 s,破碎率亦會明顯下降,這可能是由于輻射時間太短,空化效應無法破壞細胞壁所致[16]。

圖2 超聲波每次輻射時間對脂肪酶活性的影響

Fig.2 The effect of ultrasound duration of irradiation each time on the activity of lipase

2.1.3 超聲波工作總時間對脂肪酶活性的影響

選擇超聲波輸出功率為500 W、超聲波每次輻射時間為6 s,間歇時間為5 s,研究超聲波工作總時間對脂肪酶活性的影響,結果見圖3。由圖3可見,脂肪酶活性隨工作總時間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,工作總時間增加到20 min的脂肪酶基本無活性。超聲破碎時間過短(<5 min),不能有效地破壞酵母菌細胞壁,釋放脂肪酶；而破碎時間過長(>5 min),不僅會產生較多熱量,導致酶液失活,而且會使細胞中的大量雜質被提取出來,影響脂肪酶的純度[17]。

圖3 超聲波工作總時間對脂肪酶活性的影響

Fig.3 The effect of ultrasound total irradiation time on the activity of lipase

2.1.4 菌體質量濃度對脂肪酶活性的影響

稱取5份不同克數(shù)的菌泥與25 mL磷酸鹽緩沖液混合,使得菌體質量濃度分別為20、25、30、50、100 g/L,置于冰水浴中,在超聲波輸出功率為500 W、每次輻射時間為6 s,間歇時間為5 s,工作總時間為5 min的條件下破碎菌體,研究菌體質量濃度對脂肪酶活性的影響,結果見圖4。

圖4 菌體質量濃度對脂肪酶活性的影響

Fig.4 The effect of cell concentration on the activity of lipase

由圖4可知,脂肪酶活性隨菌體質量濃度的增加先升高后降低,菌體質量濃度為25 g/L的酶活力最大。菌體質量濃度較低時,液體中總蛋白質的量較少,超聲波在水中傳遞的損失較大,破碎效果較差；隨著菌體質量濃度的增加,液體中總蛋白質的量增多,提取出的蛋白質量增大,處理液黏度增大,從而不利于空化泡的形成、膨脹和爆炸,導致破碎效果較差[18]。

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交試驗

在單因素試驗的基礎上,以脂肪酶活性大小為考察指標,采用L9(34)正交表,進行4因素3水平的正交試驗。試驗設計見表1,正交試驗設計與結果見表2,方差分析結果見表3。

表1 L9(34) 正交因素設計水平表

表2 正交試驗設計與結果

以表3的方差分析結果為依據,選擇C(工作總時間)作為誤差估計項,數(shù)據分析的結果表明,在所設計的水平范圍內,B(每次輻射時間)和D(菌體質量濃度)對酶活有顯著的影響(p<0.05)。各因素對酶活的影響程度依次為B>D>A(輸出功率)>C,結合表2的K值可知,最佳提取條件為B2D2A3C3,即超聲波每次輻射時間6 s(間歇時間5 s),菌體質量濃度為25 g/L,輸出功率為550 W,超聲波工作總時間5.5 min時破碎效果最好。

表3 方差分析

2.2.2 驗證試驗

采用正交試驗確定的最佳提取條件B2D2A3C3,以脂肪酶活性為指標,進行驗證試驗。在此條件下3次測得酶活的平均值為128.46 U/g,高于正交試驗結果的最大值,故認為正交試驗得出的最優(yōu)水平是可靠的。

3 結 論

通過單因素試驗和正交試驗確定提取發(fā)酵性絲孢酵母胞內脂肪酶的最佳工藝條件為:超聲波每次輻射時間6 s(間歇時間5 s),菌體質量濃度為25 g/L,輸出功率為550 W,工作總時間5.5 min。本研究為該脂肪酶發(fā)酵條件和酶學性質的后續(xù)研究奠定了基礎。

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