14種紅樹(shù)植物對(duì)動(dòng)物病原菌的抑菌活性

鄧業(yè)成, 駱海玉, 張麗珍, 秦 卉, 廖永梅, 李瑞鈺

（廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541004）

14種紅樹(shù)植物對(duì)動(dòng)物病原菌的抑菌活性

鄧業(yè)成, 駱海玉, 張麗珍, 秦 卉, 廖永梅, 李瑞鈺

（廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541004）

采用帶藥培養(yǎng)基涂布法測(cè)定了14種紅樹(shù)植物甲醇提取物及從中分離獲得的2種純化合物對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhi）、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）和蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）9種動(dòng)物病原菌的抑菌活性。結(jié)果表明, 苦郎樹(shù)（Clerodendrum inerme）、海漆（Excoecaria agallocha）、白骨壤（Avicennia marina）、苦檻藍(lán)（Myoporum bontioides）、銀葉樹(shù)（Heritiera littoralis）和欖李（Lumnitzera racemosa）有比較廣譜的抗菌活性。苦檻藍(lán)和海漆的抑菌活性較高, 最低抑制濃度（Minimum inhibitory concentration, MIC）值分別為1～4 g/L和2～6 g/L。從苦郎樹(shù)中分離獲得的純化合物KLS-46對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌和蠟樣芽胞桿菌的MIC值分別為0.1、0.05、0.1和0.05 g/L, 對(duì)其余5種病原菌的MIC值均大于0.4 g/L。從病原菌對(duì)紅樹(shù)植物的敏感性看, 藤黃微球菌和蠟樣芽胞桿菌對(duì)紅樹(shù)植物比較敏感。

紅樹(shù)植物; 動(dòng)物病原菌; 抑菌活性

紅樹(shù)林是一類(lèi)特殊而重要的海洋植物資源, 是生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶低能海岸潮間帶, 受潮水浸淹的木本植物群落[1]。全世界紅樹(shù)植物共有 20科 27屬70種（含1變種）, 中國(guó)分布有12科25屬27種（含1變種）[2]。紅樹(shù)植物由于生長(zhǎng)在海岸潮間帶的特殊環(huán)境, 在代謝過(guò)程中形成許多陸生植物所不具備的特殊次生物質(zhì), 這些次生物質(zhì)是發(fā)現(xiàn)新型結(jié)構(gòu)抗菌物質(zhì)的天然資源庫(kù)[3]。研究表明, 紅茄苳（Rhizophora mucronata）具有抗艾滋病、抗菌、殺蟲(chóng)、抗牛痘病毒、抗腦心肌炎病毒等藥理活性[4-5]。木欖（Bruguiera gymnorrhiza）中的一些化學(xué)成分顯示了良好的抗炎和抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[6]。玉蕊（Barringtonia acutangula）有抗腫瘤和抗微生物作用[7-8]。老鼠簕（Acanthus ilicifolius）有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗炎和肝保護(hù)作用等, 其中的2-苯駢惡唑啉酮有止痛、解熱、抗驚厥、催眠、肌肉松弛、誘變、殺利什曼原蟲(chóng)（Leishmaniaspp.）和抗真菌作用, 其核糖衍生物可抗癌和抗病毒[9-10]。從海漆（Excoecaria agallocha）分離到的化合物具有顯著的抗腫瘤活性[3,11]?？梢?jiàn)紅樹(shù)植物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅樹(shù)植物的抗菌效果研究很少。作者選擇分布于廣西的14種紅樹(shù)植物, 測(cè)定了其提取物及其兩個(gè)化合物對(duì)動(dòng)物病原菌的抑菌活性, 旨在為紅樹(shù)植物的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動(dòng)物病原菌

大腸桿菌（Escherichia coli）, 綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）, 傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhi）, 痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）, 普通變形桿菌（Proteus vulgaris）, 金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）, 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）, 溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）, 蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

上述 9種動(dòng)物病原細(xì)菌由桂林醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試紅樹(shù)植物

水黃皮（Pongamia pinnata）, 鹵蕨（Acrostichum aureum）, 苦郎樹(shù)（Clerodendrum inerme）, 銀葉樹(shù)（Heritiera littoralis）, 桐花樹(shù)（Aegiceras corniculata）, 秋茄（Kadelia candel）, 海漆, 欖李（Lumnitzera racemosa）,白骨壤（Avicennia marina）, 木欖, 紅海欖（Rhizophora stylosa）, 苦檻藍(lán)（Myoporum bontioides）, 老鼠簕, 海芒果（Cerbera manghas）。

以上14種紅樹(shù)植物采自廣西防城港, 采集部位均為植物的枝葉。

1.2 方法

1.2.1 植物成分提取及分離

植物成分的提取: 采用溶劑冷浸法。將采集的植物材料放在室內(nèi)晾干, 再在 60℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至發(fā)脆, 用植物粉碎機(jī)粉碎。稱(chēng)取一定量的干粉,放入玻璃容器中, 加 5倍量的甲醇, 在室溫下浸提48 h, 抽濾。共浸提2次, 將2次濾液合并, 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在水浴中減壓濃縮, 蒸干溶劑, 得膏狀提取物。稱(chēng)質(zhì)量, 保存于4℃冰箱中備用。

（-）-epingaione的分離及鑒定: 參照 Deng[12]的方法。

KLS-46的分離: 先用液-液萃取法將苦郎樹(shù)葉甲醇提取物初步分離為石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4部分, 通過(guò)測(cè)定各萃取物對(duì)甘蔗鳳梨病菌的抑菌活性, 確定苦郎樹(shù)的抑菌活性成分主要集中在石油醚萃取物中。對(duì)石油醚萃取物用硅膠柱色譜進(jìn)行多次分離, 洗脫溶劑系統(tǒng)為石油醚/丙酮。同時(shí)測(cè)定各流分對(duì)甘蔗鳳梨病菌的抑菌活性, 最終分離得到活性流分 KLS-46。該化合物在甲醇中結(jié)晶時(shí)為無(wú)色針狀晶體, 其化學(xué)結(jié)構(gòu)正在鑒定中。

1.2.2 抑菌活性和最低抑菌濃度測(cè)定

采用帶藥培養(yǎng)基涂布法測(cè)定。參照慕立義[13]的方法并加以改進(jìn)。用丙酮和無(wú)菌水（1∶1）組成的混合溶劑溶解樣品, 配成所需濃度的藥液。在潔凈工作臺(tái)上取 1 mL藥液（對(duì)照用混合溶劑代替藥液）與 9 mL牛肉膏-蛋白胨熱培養(yǎng)基混勻, 倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中, 制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基。將保存的菌種接到牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上, 37℃培養(yǎng)24 h, 用接種環(huán)取菌落分散于無(wú)菌水中, 制備成濃度為106～107cfu/mL的菌懸液。取菌懸液0.1 mL加到培養(yǎng)基表面, 用涂布器涂布均勻, 置 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理重復(fù)3個(gè)皿。培養(yǎng)72 h后觀察記錄菌落的生長(zhǎng)情況。測(cè)定最低抑菌濃度時(shí), 制備系列濃度的帶藥培養(yǎng)基, 接菌培養(yǎng), 不長(zhǎng)菌的最低濃度即為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 14種紅樹(shù)植物甲醇提取物對(duì) 9種動(dòng)物病原菌的抑菌活性

采用帶藥培養(yǎng)基涂布法測(cè)定了14種紅樹(shù)植物甲醇提取物對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌、痢疾志賀氏菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌和蠟樣芽胞桿菌 9種動(dòng)物病原菌的抑菌活性, 結(jié)果見(jiàn)表1。在質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí), 苦郎樹(shù)、海漆和白骨壤對(duì)大腸桿菌除外的8種病原菌有抑菌活性, 苦檻藍(lán)、銀葉樹(shù)和欖李對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌除外的 7種病原菌有抑菌活性, 水黃皮和紅海欖對(duì)9種病原菌均無(wú)抑菌活性, 其余6種紅樹(shù)植物對(duì)1～4種病原菌有抑菌活性。表明苦郎樹(shù)、海漆、白骨壤、苦檻藍(lán)、銀葉樹(shù)和欖李 6種紅樹(shù)植物有比較廣譜的抗菌活性。從病原菌對(duì)紅樹(shù)植物的敏感性看, 藤黃微球菌和蠟樣芽胞桿菌對(duì)紅樹(shù)植物比較敏感, 有 11種紅樹(shù)植物對(duì)它們有抑菌活性, 大腸桿菌不敏感, 所有紅樹(shù)植物對(duì)它均無(wú)抑菌活性, 綠膿桿菌比較不敏感,有11種紅樹(shù)植物對(duì)它無(wú)抑菌活性。

2.2 12種紅樹(shù)植物提取物及2種化合物對(duì)動(dòng)物病原菌的最低抑菌濃度

采用帶藥培養(yǎng)基涂布法進(jìn)一步測(cè)定了在質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)有抑菌活性的12種紅樹(shù)植物甲醇提取物對(duì)動(dòng)物病原菌的最低抑菌濃度, 同時(shí)還測(cè)定了從苦檻藍(lán)和苦郎樹(shù)中分離獲得的 2個(gè)純化合物的最低抑菌濃度, 結(jié)果見(jiàn)表2。在抗菌譜比較廣的6種紅樹(shù)植物中, 苦檻藍(lán)和海漆的抑菌活性較高, MIC值分別為1～4 g/L和2～6 g/L。欖李的MIC值為1～8 g/L, 苦郎樹(shù)和銀葉樹(shù)的MIC值為2～10 g/L, 白骨壤的MIC值為4～10 g/L。在2種純化合物中, （-）-epingaione對(duì)所測(cè)定的9種動(dòng)物病原菌的MIC值均大于0.4 g/L,即在濃度為0.4 g/L時(shí)均無(wú)抑菌活性; KLS-46對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌和蠟樣芽胞桿菌的MIC值分別為0.1、0.05、0.1和0.05 g/L, 對(duì)其余5種動(dòng)物病原菌的MIC值均大于0.4 g/L。

表1 14種紅樹(shù)植物提取物對(duì)動(dòng)物病原菌的抑菌活性Tab. 1 Inhibitory activity of extracts from 14 mangrove plants against animal pathogens

表2 12種紅樹(shù)植物提取物及2種化合物對(duì)動(dòng)物病原菌的最低抑菌濃度Tab. 2 The MIC values of extracts and two compounds from 12 mangrove plants against animal pathogens

3 討論

海洋生物藥物是目前研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一,紅樹(shù)植物是海洋生物的一部分, 除了在海洋生態(tài)方面具有重要功能外, 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有多種藥理功效和用途, 具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn), 從廣西防城港紅樹(shù)林采集的14種紅樹(shù)植物大多數(shù)對(duì)動(dòng)物病原菌有抗菌活性, 其中苦郎樹(shù)、海漆、白骨壤、苦檻藍(lán)、銀葉樹(shù)和欖李 6種紅樹(shù)植物的抗菌譜比較廣, 在提取物質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)對(duì)9種供試病原菌中的 7種以上有抗菌活性, 苦檻藍(lán)和海漆的抗菌活性較高, MIC值分別為1～4 g/L和2～6 g/L。所以這些紅樹(shù)植物作為抗菌藥在醫(yī)藥領(lǐng)域有開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。作者在以前的研究工作中已發(fā)現(xiàn)多種紅樹(shù)植物提取物對(duì)植物病原真菌有抗菌活性[14], 并從苦檻藍(lán)中分離鑒定出抗菌物質(zhì)（-）-epingaione[12], 從苦郎樹(shù)中分離出抗菌物質(zhì)KLS-46, 這2種抗菌物質(zhì)對(duì)植物病原真菌均有很好的抗菌活性, 在農(nóng)藥領(lǐng)域也有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。在本研究中發(fā)現(xiàn), 苦檻藍(lán)中的抗菌物質(zhì)（-）-epingaione對(duì)供試的 9種動(dòng)物病原菌在濃度為0.4 g/L時(shí)沒(méi)有抑菌活性, 而苦檻藍(lán)甲醇提取物對(duì)其中的 7種動(dòng)物病原菌抑菌活性較高, 推測(cè)苦檻藍(lán)對(duì)植物病原真菌和動(dòng)物病原細(xì)菌的抗菌活性物質(zhì)不同,還有其他的抗菌活性物質(zhì)存在。苦郎樹(shù)中的抗菌活性物質(zhì)KLS-46只對(duì)部分動(dòng)物病原細(xì)菌有活性, 與其提取物的抗菌譜不一致, 推測(cè)也可能還有其他抗菌活性物質(zhì)存在。所以, 要明確這2種紅樹(shù)植物的抗菌活性物質(zhì)還需要進(jìn)一步研究。對(duì)其他抗菌活性高且抗菌譜較廣的紅樹(shù)植物也有待進(jìn)一步研究其抗菌活性物質(zhì), 這將有助于從紅樹(shù)植物中發(fā)現(xiàn)更多抗菌活性物質(zhì), 為抗菌藥物的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Received: Apr.,21, 2011

Key words:mangrove plants; animal pathogens; inhibitory activity

Abstract:The inhibitory activity of methanol extracts from fourteen mangrove plants and two isolated compounds againstEscherichia coli,Pseudomonas aeruginosa,Salmonella typhi,Shigella dysenteriae,Proteus vulgaris,Staphyloccocus aureus,Micrococcus luteus,Micrococcus lysodeikticusandBacillus cereuswas determined using plate culture medium coating method. The results showed that the extracts ofClerodendrum inerme,Excoecaria agallocha,Avicennia marina,Myoporum bontioides,Heritiera littoralisandLumnitzera racemosaexhibited broad-spectrum antibacteria activity. The inhibitory activity ofM.bontioidesandE.agallochawas relatively high and the MIC value was 1-4 and 2-6 g/L, respectively. The KLS-46 purified fromC.inermehad the MIC values of 0.1, 0.05, 0.1 and 0.05 g/L againstS.typhi,S.aureus,M.lysodeikticusandB.cereus, respectively, but showed almost inactive against the other five pathogens with MIC value more than 0.4 g/L. TheM.luteusandB.cereuswere more sensitive to the extracts from mangrove plants.

（本文編輯:譚雪靜）

Inhibitory activity of fourteen mangrove plants against animal pathogens

DENG Ye-cheng, LUO Hai-yu, ZHANG Li-zhen, QIN Hui, LIAO Yong-mei, LI Rui-yu
（College of Life Science, Guangxi Normal University, Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection（Guangxi Normal University）, Ministry of Education, Guilin 541004, China）

S 435.72

A

1000-3096（2012）03-0037-05

2011-04-21;

2011-12-21

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（桂科自 0991097）; 珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研項(xiàng)目（桂科能1001Z014）

鄧業(yè)成（1965-）, 男, 廣西全州人, 教授, 博士, 主要從事天然產(chǎn)物研究, E-mail: dyecheng@163.com