池養(yǎng)烏蘇里擬鲿雌雄魚生長及周年性激素與性腺發(fā)育研究

(蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,蘇州大學(xué) 水產(chǎn)研究所,江蘇 蘇州 215123)

烏蘇里擬鲿(Pseudobagrus ussuriensis)隸屬于鲇形目(Silurformes)、鲿科(Bagridae)、擬鲿屬(Pseudobagrus),分布于我國黑龍江至珠江的各水系以及我國長江和淮河水系的太湖、洪澤湖等水域,其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美,價格昂貴,但近年來其資源量銳減。因此,開展其人工繁殖和商品魚養(yǎng)殖以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究十分必要。有關(guān)烏蘇里擬鲿的研究報道僅見于人工繁殖技術(shù)及分子生物學(xué)等方面的初步研究[1-6],對其性別發(fā)育及生殖生理方面研究還較少。作者在對該魚進(jìn)行人工繁殖的基礎(chǔ)上,開展了池塘養(yǎng)殖條件下該雌、雄魚生長規(guī)律以及性成熟魚周年性腺發(fā)育與性激素變化特性的研究。以期為探明該雌、雄魚的生長和性成熟規(guī)律提供基礎(chǔ)資料,也為開展該魚的種質(zhì)資源保護(hù)和商品魚養(yǎng)殖實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從2009年6月份至2011年11月份,在池塘中將人工繁殖的烏蘇里擬鲿魚苗分別按夏花魚種培育、一齡魚種培育、商品魚養(yǎng)殖和親魚培育環(huán)節(jié),按照常規(guī)魚類雌、雄魚同一池塘單一品種養(yǎng)殖的模式進(jìn)行人工配合飼料投喂飼養(yǎng)。每月25日對池養(yǎng)雌、雄魚的體長和體質(zhì)量生長情況進(jìn)行跟蹤檢測。在2010年12月份(2齡)和2011年4、5、6、10月份(3齡)的每月25日隨機(jī)取樣雌、雄魚各 20尾,在測量體長、體質(zhì)量的同時使用一次性注射器采血1mL于離心管內(nèi),以用于性激素測定;稱取性腺質(zhì)量,用于計算成熟度;并將性腺置于 4%甲醛溶液中固定,用于組織學(xué)觀察。

1.2 材料制備與實(shí)驗方法

1.2.1 生長數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對現(xiàn)場測得的烏蘇里擬鲿各月份體長和體質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,獲得體長、體質(zhì)量與生長時間的關(guān)系,并利用W=aLb模型對體質(zhì)量和體長的關(guān)系進(jìn)行擬合,分別獲得雌、雄魚體長和體質(zhì)量擬合曲線。

1.2.2 豐滿度與成熟度測量

根據(jù)烏蘇里擬鲿雌、雄成魚不同月份平均體長、體質(zhì)量和性腺質(zhì)量,分別計算雌、雄魚的豐滿度和成熟度。計算公式為：

豐滿度=[體質(zhì)量/ (體長3)]× 100%;成熟度= (性腺質(zhì)量/體質(zhì)量) × 100%。

1.2.3 激素測定

分別將采集到的烏蘇里擬鲿雌、雄成魚新鮮血液,于4℃靜置4 h,10 000 rpm離心10 min,取上清液獲得血清樣本,利用 I125放射免疫試劑盒(購自北京科美生物技術(shù)公司)以及γ放免計數(shù)器檢測各樣本的雌二醇(E2)和睪酮(T)激素含量。

1.2.4 組織學(xué)觀察

用固定液充分固定性腺組織,水洗后轉(zhuǎn)入梯度乙醇中脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,使用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片8 nm,貼片并采用蘇木精-伊紅染色,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡檢并拍照。12月份、4月份和10月份的卵巢組織內(nèi)部黏連性比較好,采用整體石蠟包埋后橫切面觀察,5月份和6月份卵巢中卵子之間黏連性較差,因此采用包埋單個卵子切片觀察的方法。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 烏蘇里擬鲿雌、雄魚生長規(guī)律

2.1.1 烏蘇里擬鲿雌、雄魚的體質(zhì)量和體長生長比較

如圖1所示,1齡烏蘇里擬鲿雌、雄生長曲線基本相似,隨著生長時間的推移,雌、雄魚的體長和體質(zhì)量差異逐漸增大,從2齡開始,雄性烏蘇里擬鲿體長和體質(zhì)量生長增長值顯著大于雌性魚(P＜0.05),池塘養(yǎng)殖3齡雄性烏蘇里擬鲿11月份時的體質(zhì)量和體長分別是雌性魚的235.2%和150.3%。圖2分別顯示烏蘇里擬鲿雌、雄魚的體質(zhì)量體長關(guān)系曲線,擬合曲線的模型為：W=aLb。雌性魚的體長體質(zhì)量關(guān)系式為：W=0.182 5L1.9646(R2=0.944 5);雄性魚的體長體質(zhì)量關(guān)系式為：W=0.188 1L2.005(R2=0.961 8)。

圖1 烏蘇里擬鲿雌、雄魚體質(zhì)量(A)和體長(B)生長比較Fig.1 Growth comparison of female and male Pseudobagrus ussuriensis

圖2 烏蘇里擬鲿雌性(A)和雄性(B)體質(zhì)量和體長關(guān)系擬合曲線Fig.2 Curve fitting of female and male Pseudobagrus ussuriensis’s weight and length

2.1.2 烏蘇里擬鲿雌、雄成魚周年豐滿度變化

如圖3所示,烏蘇里擬鲿雄性成魚的豐滿度從2010年12月份到翌年3月份逐漸降低,4到6月份保持同一水平,7月份又下降至低谷,而8到10月份則有所上升。雌性成魚各月份的豐滿度均高于雄性成魚(P＜0.05),且隨月份而變化的趨勢與雄成魚基本相似,只是翌年3月份的豐滿度并未下降,且處于最高水平。

圖3 烏蘇里擬鲿雌、雄魚周年豐滿度Fig.3 Seasonal changes in relative fatness of female and male Pseudobagrus ussuriensis

2.2 烏蘇里擬鲿雌、雄成魚周年性類固醇激素水平

2.2.1 雌、雄成魚周年雌二醇(E2)水平

如圖4顯示,雌、雄烏蘇里擬鲿成魚E2水平的周年變化均呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律,且最高值均出現(xiàn)在5月份;除12月份以外的各月份,雌性成魚的E2水平均顯著高于雄性成魚(P＜0.05),尤其在5月份和4月份(P＜0.01)。

圖4 烏蘇里擬鲿不同月份雌、雄魚E2水平Fig.4 Seasonal changes in E2 level of female and male Pseudobagrus ussuriensis

2.2.2 雌、雄成魚周年睪酮(T)水平

由圖5可知,除12月份以外的各月份,雌性烏蘇里擬鲿成魚 T水平均顯著高于雄性成魚(P＜0.05),且其周年變化趨勢與 E2基本相似,在5月份出現(xiàn)最高值,4月份次之;而雄性成魚T的最高值出現(xiàn)在4月份,5月份出現(xiàn)顯著下降(P＜0.05)。

2.3 烏蘇里擬鲿雌、雄成魚周年性腺發(fā)育情況

2.3.1 烏蘇里擬鲿雌、雄成魚周年成熟度變化

如圖6顯示,烏蘇里擬鲿雌、雄成魚周年成熟度的變化趨勢基本一致,均從12月份到翌年6月份逐漸上升,在 10月份時下降;其中,雌性成魚成熟度的周年變化幅度顯著高于雄性,尤其從4月至6月份的性腺發(fā)育成熟季節(jié)成熟度出現(xiàn)了快速上升。

圖5 烏蘇里擬鲿不同月份雌、雄魚T水平Fig.5 Seasonal changes in T level of female and male Pseudobagrus ussuriensis

圖6 烏蘇里擬鲿不同月份雌、雄魚成熟度水平Fig.6 Seasonal changes in gonad maturity of female and male Pseudobagrus ussuriensis

2.3.2 卵巢發(fā)育形態(tài)及組織學(xué)

將烏蘇里擬鲿腹部從泄殖孔剪開至鰓部,取出內(nèi)臟團(tuán)后,靠近背部顯露出成對出現(xiàn)的卵巢,呈長囊形,在末端連接至泄殖孔。對各月份卵巢的外觀和組織學(xué)觀察后,根據(jù)我國一般采用六期劃分法以及黃顙魚等近源物種的性腺分期特征[7-8],對烏蘇里擬鲿卵巢的觀察和分期結(jié)果見圖7。

12月25日卵巢呈淡紅色,外膜上有血管分布,肉眼可隱約看到卵粒, 圖版Ⅰ-1示卵巢中已有卵黃開始形成的第Ⅲ期卵母細(xì)胞,也有部分Ⅰ、Ⅱ時相的卵母細(xì)胞,據(jù)此判斷,12月份卵巢已達(dá)到第Ⅲ期。

4月25日卵巢呈淡黃色,比12月份卵巢膨大一倍,卵巢壁開始透明,肉眼可見內(nèi)部卵粒,圖版Ⅰ-2示卵巢中大部分卵細(xì)胞已沉積較多卵黃物質(zhì),還有一小部分處于Ⅱ期的細(xì)胞,此時卵巢處于Ⅳ期的早期(Ⅳ+)。

5月25日卵巢體積膨大,占據(jù)整個腹腔的大部分,外膜血管退去,膜中卵粒飽滿密集,但卵粒還黏連在一起,組織學(xué)觀察已經(jīng)出現(xiàn)成熟卵細(xì)胞,由此可推斷此時的卵巢處于第Ⅳ期的晚期(Ⅳ+++),圖版Ⅰ-3示已出現(xiàn)的第Ⅴ期卵母細(xì)胞,細(xì)胞核消失,內(nèi)部充滿卵黃物質(zhì)。

6月25日雌性卵巢體積膨大,占據(jù)整個腹腔的大部分,外觀淡黃色,外膜上未見血管,膜中充滿卵粒,比5月份時更飽滿些,卵粒間黏連減少,出現(xiàn)游離的卵粒;成熟卵細(xì)胞的橫切片(圖版Ⅰ-4)可見卵膜包裹的卵黃,靠近卵黃膜的周圍有空泡。由此可推斷6月底卵巢處于第Ⅴ期。

10月25日雌性卵巢體積明顯縮小,部分前端為淡紅色,其余為黃白色,按壓卵巢時觸感松軟,組織學(xué)觀察卵巢內(nèi)部是中空的,有部分未排出的卵細(xì)胞和大部分處于第Ⅱ時相的卵母細(xì)胞,由此可推斷該月份卵巢處于第Ⅵ期。圖版Ⅰ-5示卵巢橫切面,示中空的卵巢、未排出的卵細(xì)胞和第Ⅱ時相卵母細(xì)胞。

圖7 烏蘇里擬鲿卵巢的觀察和分期Fig.7 Observation and phase division of Pseudobagrus ussuriensis ovary

2.3.3 精巢發(fā)育形態(tài)及組織學(xué)

烏蘇里擬鲿精巢為小葉型,前端兩分支在中部匯合后連接泄殖孔,整體呈“Y”字形,每個分支上都分化出許多細(xì)葉狀結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗截取單個細(xì)葉狀分支橫截面進(jìn)行觀察,觀察和分期結(jié)果如下：

12月25日精巢外形較細(xì)小,黃白色,如圖版Ⅰ-6顯示,組織切片內(nèi)部一致為被染色較淺的初級精母細(xì)胞,此時精巢發(fā)育至第Ⅲ期。

4月25日精巢體積開始變大,顏色由黃色開始變白,如圖版Ⅰ-7顯示,精小葉中的初級精母細(xì)胞開始發(fā)育為次級精母細(xì)胞,此時精巢處于第Ⅳ期的初期。

5月25日精巢體積繼續(xù)變大,顏色比4月份時更白,體積膨大一倍。如圖版Ⅰ-8顯示,精小葉中充滿了次級精母細(xì)胞以及精子,此時精巢處于第Ⅳ期的后期。

6月25日精巢外觀更加膨大,乳白色,如圖版Ⅰ-9顯示,精小葉中的精小囊開始破裂,釋放精子于精小葉中,該時期精巢已達(dá)到第Ⅴ期。

10月25日精巢恢復(fù)為12月份大小,顏色開始泛黃,如圖版Ⅰ-10顯示,精小葉中空隙較大,此時精巢已經(jīng)退化,但可見部分初級精母細(xì)胞,此時精巢處于第Ⅵ期,即將進(jìn)入第Ⅲ期開始下一周期的發(fā)育。

3 討論

3.1 魚類生長規(guī)律與雌、雄魚生長的差異

池塘養(yǎng)殖魚類中,雌、雄魚體型和生長差異較大的情況比較普遍,如鯉魚和鯽魚的雌性魚比雄性魚生長速度快,雌、雄鱖魚的體長/體高差異很顯著[9]。本實(shí)驗結(jié)果顯示,烏蘇里擬鲿雄魚隨著生長時間的推移,生長速度明顯大于雌魚。3齡雄性烏蘇里擬鲿在養(yǎng)殖池塘中11月份時的體質(zhì)量和體長分別是雌性魚的235.2%和150.3%,表明該種魚類的性別生長差異非常突出。雌、雄魚體長體質(zhì)量關(guān)系式W=aLb中b值均小于 3,由此推斷雌、雄魚生長均呈異速生長,即體長生長速度大于體質(zhì)量生長速度[10]。將生長曲線與豐滿度曲線對比發(fā)現(xiàn),隨著體質(zhì)量和體長的快速增加,雌、雄成魚的豐滿度卻逐漸下降,這進(jìn)一步表明了該種魚類具有體長生長快于體質(zhì)量生長的異速生長特性。這一現(xiàn)象在雄性成魚中尤為明顯,成年雄魚體態(tài)較細(xì)長,豐滿度低于成年雌魚,隨著年齡的增長,其體型也越顯細(xì)長。

3.2 魚類性激素水平與性腺發(fā)育的關(guān)系

本實(shí)驗對池養(yǎng)烏蘇里擬鲿捕撈后現(xiàn)場及時采血,盡量避免了長距離運(yùn)輸導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)對激素分泌產(chǎn)生的影響,并采用I125放射免疫方法測量血清中的性激素含量,具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)。但由于魚類的激素水平容易受到環(huán)境等因素的影響,其平行樣本間的差異仍然較大,這在相關(guān)研究中也有類似現(xiàn)象[11-13]。盡管如此,本研究結(jié)果顯示烏蘇里擬鲿雌、雄魚的E2和T水平在不同月份間仍具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

從本研究結(jié)果(圖4和圖5)也可看出,雌性魚在E2和T水平上均明顯高于雄性魚,雌、雄魚E2水平和雌魚T水平的最高值均在5月底,此時卵巢和精巢均發(fā)育達(dá)到第Ⅳ期后期(Ⅳ+++)。因此,雌魚和雄魚E2的高水平均可直接促進(jìn)卵巢和精巢的發(fā)育[14];而雌魚 T的高水平現(xiàn)象可能是因為 E2是由 T轉(zhuǎn)化而來,雌性魚在卵巢發(fā)育中,需要分泌大量 T作為合成 E2的前體,因此本實(shí)驗檢測也發(fā)現(xiàn)烏蘇里擬鲿雌、雄魚的T 水平出現(xiàn)顯著升高的時間均比E2要早,且維持較高水平的時間較長,暗示T在雌、雄魚在性腺發(fā)育和繁殖等生理活動中發(fā)揮著重要作用。在對國內(nèi)外硬骨魚類性類固醇激素的研究中,普遍認(rèn)為性激素的水平直接影響著雌、雄魚的繁殖活動。海鱸(Dicentrarchus labraxL.)血漿中E2和T水平在繁殖期達(dá)到高峰,T水平在繁殖期后的2～3個月時又一次達(dá)到高峰,可能是為下一次的發(fā)育做準(zhǔn)備[15]。露斯塔野鯪(Labeo rohita)血漿E2和T水平在4月份達(dá)到高峰,5月份產(chǎn)生成熟卵泡時降低[16];與烏蘇里擬鲿同屬鯰形目的印度鲇魚、革胡子鲇、斑點(diǎn)叉尾等血漿中的 E2水平隨著卵黃的積累而不斷上升,在產(chǎn)卵發(fā)生的后期下降[11];烏塘鱧在卵巢發(fā)育至Ⅴ期時 E2水平急速下降[17],這些研究結(jié)果與本實(shí)驗結(jié)果相符。值得注意的是,一方面雄性烏蘇里擬鲿全年除12月份以外的各月份的性激素(E2和 T)水平均顯著低于雌魚(P＜0.05);另一方面雄性魚的T含量水平在4月底達(dá)到最高,此時精巢發(fā)育處于第Ⅳ期的初期,而當(dāng) 5月底精巢發(fā)育達(dá)到第Ⅳ期后期時,T水平比4月底反而顯著降低(P＜0.01),并且此時 E2的水平也顯著低于雌性魚(P＜0.01)。因此,該雄性魚的性腺較難成熟。作者在該魚的人工繁殖生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn),雄性烏蘇里擬鲿的成熟度較雌性魚要差,人工催產(chǎn)后的雌性魚能很好地排卵和產(chǎn)卵,而雄性魚即使人工催產(chǎn)后也難以順利地排精和產(chǎn)精,目前實(shí)際生產(chǎn)上一般只能采用殺魚取精的方法才能完成人工授精。所以,如何通過技術(shù)手段提高雄性魚自身性激素的分泌量,或通過改進(jìn)人工催產(chǎn)技術(shù)適時、適量地注射外源性激素,促使雄魚自然排精,值得進(jìn)一步研究。

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