維生素A、D對肉雞鈣磷代謝相關(guān)激素水平的影響

曹 平孫建萍閆素梅 方麗惠,3史彬林郭曉宇付果花

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.錫林郭勒職業(yè)學院，內(nèi)蒙古錫林浩特 026005；3.包頭師范學院，內(nèi)蒙古包頭 014030）

骨骼代謝障礙是降低肉雞生產(chǎn)中經(jīng)濟效益的重要因素之一。目前，在肉雞生產(chǎn)中，為了提高生產(chǎn)性能和免疫性能，生產(chǎn)廠家往往添加較高劑量的維生素A。然而，許多研究表明，維生素A過量是引起肉雞鈣磷代謝異常、骨骼發(fā)育不良及生長發(fā)育遲緩的原因之一[1-3],但關(guān)于過量維生素A對肉雞鈣磷代謝影響的機理研究很少。鈣結(jié)合蛋白（CaBP）主要存在于鳥類的腸道組織中，有研究發(fā)現(xiàn)，小腸上皮細胞內(nèi)CaBP含量與腸鈣吸收量呈正相關(guān)，因此認為CaBP在禽類腸鈣吸收過程中起重要作用（Bouhtiauy等，1994）[4]。骨鈣素（BGP）是由成骨細胞合成的一種依賴于維生素K非膠原蛋白，存在于骨骼組織中。血液BGP含量與成骨細胞的活性呈正相關(guān)，與骨的形成有關(guān)，可作為骨形成的標志物（Demer，1992）[5]。維生素 D3在肝細胞微粒體和線粒體中25-羥化酶的作用下，生成25-(OH)D3。隨后進入腎臟，在腎小管細胞線粒體的1-α羥化酶催化下，25-(OH)D3轉(zhuǎn)化成維生素D的最終活性形式1,25-(OH)2D3，然后轉(zhuǎn)運到腸道、腎臟或其它靶組織中，調(diào)節(jié)鈣磷代謝。Metz等（1985）[6]的研究指出，給幼齡火雞飼喂大劑量維生素A和正常劑量的維生素D3以后,火雞出現(xiàn)類似佝僂病的癥狀；但在給火雞飼喂大劑量維生素A的同時，飼喂大劑量的維生素D3，火雞的骨骼生長基本正常，提示維生素D對維生素A具有一定拮抗作用，同時也說明維生素A過量對火雞的骨骼發(fā)育是否產(chǎn)生負面影響，與維生素D的添加劑量有關(guān)。金久善等（1994）[7]的研究指出，乳?？诜髣┝康木S生素A造成骨骼鈣磷代謝的紊亂，與過量的維生素A對維生素D3的拮抗作用有關(guān)，結(jié)果表明，大劑量維生素A組的乳牛維生素D3的活性代謝產(chǎn)物25-羥維生素D3和1，25-二羥維生素D3的生成減少，進而影響鈣磷代謝。此外，肉雞的鈣磷代謝過程還受到甲狀旁腺激素（PTH）及降鈣素（CT）等激素的調(diào)節(jié)（Meyer等，1992）[8]。維生素A過量對肉雞鈣磷代謝的影響可能與這些活性物質(zhì)或激素的分泌發(fā)生改變有關(guān)，同時也與維生素D的添加劑量有關(guān)，但相關(guān)的研究報道極少。鑒于此，本論文在前期試驗研究的基礎(chǔ)上，通過研究維生素A、D對鈣磷代謝相關(guān)激素水平的影響，進一步探討過量維生素A對肉雞骨骼代謝的影響機理，為科學確定日糧中維生素A、D的適宜添加量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)管理與基礎(chǔ)日糧

試驗雞采用涂塑肉雞籠單層籠養(yǎng)，雞籠均采用紅外線加熱裝置自動控溫。試驗雞自由采食，自由飲水，按常規(guī)的免疫程序進行免疫。各組的試驗條件均保持一致。每天觀察雞群精神狀態(tài)，其余管理同肉雞常規(guī)飼養(yǎng)管理。試驗的基礎(chǔ)日糧除維生素A、D按照試驗設計添加外，其他營養(yǎng)成分均滿足肉仔雞的營養(yǎng)需要?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平詳見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

1.2 試驗動物及分組

試驗選擇8日齡健康艾維茵雄性肉雞384只，隨機分成16個處理組，每個處理3個重復組，每個重復組8只雞。采用4×4完全隨機試驗設計，在基礎(chǔ)日糧中分別添加不同劑量的維生素A、D構(gòu)成試驗日糧。其中維生素A設4個添加水平，分別為1 500、3 000、15 000和45 000 IU/kg日糧，維生素D設4個添加水平，分別為 500、1 250、2 500和5 000 IU/kg日糧，共構(gòu)成16個處理組的試驗日糧。

1.3 樣本采集

試驗進行至第35 d，早8：00，在每個重復組中隨機抽取2只雞，每處理6只，翅靜脈采血10ml放置于普通采血管(非抗凝)中，在4℃下3000r/min離心制備血清，－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測試項目與方法

1.4.1 血清CaBP含量

血清CaBP含量采用放射免疫分析法(RIA)測定。測試儀器為GC-911-γ-放射免疫計數(shù)器(中國科技大學實業(yè)總公司生產(chǎn))，檢測試劑盒由美國Sigma公司提供。

1.4.2 血清BGP、CT含量

血清BGP、CT含量采用放射免疫分析法（RIA）測定。測試儀器為GC-911-γ-放射免疫計數(shù)器(中國科技大學實業(yè)總公司生產(chǎn))，檢測試劑盒由北京華英生物技術(shù)研所提供。

1.4.3 血清活性維生素D3與PTH含量

血清活性維生素D3與PTH含量采用放射免疫分析法（RIA）測定。測試儀器為GC-911-γ-放射免疫計數(shù)器(中國科技大學實業(yè)總公司生產(chǎn))?；钚跃S生素D3檢測試劑盒由美國索靈(DIASORIN)公司提供，PTH檢測試劑盒由美國實驗室診斷系統(tǒng)DSL有限公司提供。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)利用SAS(SAS Institute，1998)軟件的Anova法進行方差分析，Duncan氏法進行多重比較，同時對不同維生素A、D的日糧處理主效應分別進行一次線性回歸和一元二次回歸分析。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，P＜0.10表示差異趨于顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素A、D對肉雞血清CaBP、BGP含量的影響（見表2)

由表2可以看出，維生素A水平對血清CaBP含量無顯著的影響（P=0.79），但回歸分析統(tǒng)計結(jié)果表明，血清CaBP含量與日糧維生素A水平的增加劑量趨于顯著的一次線性降低劑量依賴關(guān)系(P=0.092)，回歸方程為 y=-3.652E-5x+32.21，R2＝0.82。式中，x 為日糧維生素A的添加量；y為血清CaBP含量。其中，以1 500、3 000 IU/kg維生素 A組較高，15 000 IU/kg維生素A組較低，45 000 IU/kg維生素A組最低。日糧維生素D及維生素A、D交互作用對血清CaBP含量無顯著影響（P=0.57，P=0.72）。結(jié)果也表明，日糧維生素A水平對肉雞血清BGP含量的影響趨于顯著 (P=0.08)，其中，45 000 IU/kg維生素A組血清BGP含量最低，有明顯低于1 500 IU/kg維生素A組的趨勢?；貧w分析結(jié)果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清BGP含量呈現(xiàn)一定的一次線性降低趨勢 (P=0.17)，回歸方程為 y=-3.80E-6x+3.46，R2＝0.69。式中，x為日糧維生素A的添加量，y為血清BGP含量。日糧維生素D對血清BGP含量無顯著影響(P=0.54)，但隨著日糧維生素D水平的增加，血清BGP含量呈現(xiàn)一定的一次線性增加趨勢 (P=0.14)，回歸方程為y=3.69E-5x+3.34，R2＝0.74。式中，x為日糧維生素 D 的添加量，y為血清BGP含量。維生素A、D交互作用對血清BGP含量無明顯的互作效應(P=0.67)。

表2 日糧維生素A、D對肉雞血清CaBP、BGP含量的影響

2.2 維生素A、D對肉雞血清CT、PTH及維生素D3含量的影響(見表3)

表3 日糧維生素A、D對肉雞血清CT、PTH和VD3的影響

表3的結(jié)果表明，日糧維生素A、D水平及其交互作用對血清CT含量均無顯著影響(P＞0.05)。但回歸分析統(tǒng)計結(jié)果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CT含量呈現(xiàn)一定的一次線性降低趨勢(P=0.18)，回歸方程為y=-0.21E-3x+128.73，R2=0.67。式中，x為日糧維生素A的添加量；y為血清CT含量。其中，1 500 IU/kg維生素 A組最高，3 000、15 000 IU/kg維生素A組較低，尤以45 000 IU/kg維生素A組最低。日糧維生素A水平對血清PTH含量雖然無顯著的影響(P=0.20)，但回歸分析統(tǒng)計結(jié)果表明，血清PTH含量隨著日糧維生素A水平的增加而增加，并呈顯著的一次線性(P=0.029)劑量依賴關(guān)系，回歸方程為y=8.31E-5x+30.84，R2=0.94。式中，x為日糧維生素A的添加量，y為血清PTH含量。其中，15 000、45 000 U/kg維生素A組血清PTH含量較高，尤以45 000 IU/kg維生素A組最高。日糧維生素D水平及維生素A、D交互作用對血清PTH含量均無顯著影響 (P=0.88，P=0.95)。

日糧維生素A水平對血清維生素D3含量無顯著影響(P=0.87)。但回歸分析統(tǒng)計結(jié)果表明，血清維生素D3含量隨著日糧維生素A水平的增加而降低，并呈一定的一元二次(P=0.12)劑量依賴關(guān)系，回歸方程為y=6.38E-9x2-3.57E-4x+37.66，R2=0.99。式中，x為日糧維生素A的添加量，y為血清維生素D3含量。日糧維生素D水平對血清維生素D3含量的影響趨于顯著(P=0.08)，5 000 IU/kg維生素D組血清維生素D3含量較其它三組有顯著增加趨勢，2 500 IU/kg維生素D組血清維生素D3含量也較高；回歸分析結(jié)果表明，血清維生素D3含量與日糧維生素D水平間呈現(xiàn)趨于顯著的一次線性增加的劑量依賴關(guān)系(P=0.093)，回歸方程為y=0.002 4x+30.07，R2=0.82。式中，x為日糧維生素D的添加量，y為血清維生素D3含量。維生素A、D交互作用對血清維生素D3含量無顯著影響(P=0.42)。

3 討論

3.1 日糧維生素A對肉雞血清CaBP、BGP、CT、PTH及維生素D3含量的影響

很多資料研究得出，過量的維生素A可引起肉雞鈣磷代謝的紊亂。閆素梅等（2007）[2]、馮永淼等（2007）[3]的前期試驗研究進一步驗證了該結(jié)果，研究表明：日糧添加過量的維生素A（45 000 IU/kg）時，肉雞脛骨強度顯著降低，生長發(fā)育有顯著的降低趨勢；日糧添加臨界過量的維生素A（15 000 IU/kg）時，脛骨鈣含量、血清AKP活性有降低的趨勢，脛骨磷含量升高，生長發(fā)育有顯著的降低趨勢；但關(guān)于其影響機理尚不十分清楚。CaBP主要存在于鳥類的腸道組織中，研究發(fā)現(xiàn)小腸上皮細胞內(nèi)CaBP含量與腸鈣吸收量呈正相關(guān)，因此認為CaBP在禽類腸鈣吸收過程中起重要作用（Bouhtiauy等，1994）[4]。本試驗結(jié)果顯示，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CaBP含量呈趨于顯著的一次線性降低趨勢（P＜0.10）；其中，以 15 000、45 000 IU/kg維生素A組較低，45 000 IU/kg維生素A組對其降低效果更為明顯。血清CaBP濃度的降低，可能會引起鈣在腸道中的吸收受阻，進而引起骨骼鈣磷代謝異常。關(guān)于維生素A過量引起血清CaBP濃度降低的機制尚不清楚。Matsumoto等（1998）[9]的研究發(fā)現(xiàn)，維生素A的中間代謝產(chǎn)物視黃酸參與依賴維生素D的CaBP基因表達。馮永淼（2007）[10]試驗研究表明，隨著日糧維生素A添加量的增加，十二指腸CaBP基因表達降低，當維生素A水平增加至15 000、45 000 IU/kg時，十二指腸的CaBP基因表達量有下降的趨勢，提示日糧維生素A過量（15 000～45 000 IU/kg）時，可引起肉雞的血清CaBP濃度降低，與其抑制了組織中CaBP基因表達有關(guān)，進而影響了鈣磷代謝。

BGP又稱骨依賴維生素K蛋白，主要由成骨細胞合成、釋放，并分泌于骨基質(zhì)中。血液BGP含量與成骨細胞的活性呈正相關(guān)，與骨的形成有關(guān)，可作為骨形成的標志物（Demer，1992）[5]。早期研究結(jié)果表明，BGP在骨骼生長、羥磷灰石沉積時增加，有利于骨骼的生長，在調(diào)節(jié)骨骼代謝中起著重要的作用[11]。本試驗結(jié)果得出，維生素A過量組（15 000、45 000 IU/kg）的血清BGP含量呈顯著的降低趨勢。由此推斷，日糧過量維生素A對肉雞骨骼發(fā)育及鈣磷代謝的負面影響與BGP的濃度降低進而影響骨骼的礦化過程有關(guān)。關(guān)于維生素A引起B(yǎng)GP濃度降低的機理研究尚不多見。陶天遵等（2005）[12]指出，維生素K是BGP中谷氨酸γ位羧化的重要輔酶，影響B(tài)GP的生物活性與生物合成。當日糧維生素K缺乏時，引起動物機體血清與骨骼中BGP的濃度下降，造成骨礦化過程不能進行(Iber，1989)[13]。夏兆飛（1997）[14]的研究結(jié)果表明，大劑量的維生素A抑制骨鈣素（BGP）的合成，降低血清鈣磷水平，造成肉雞脛骨礦化不全，引起骨骼代謝異常。

CT是由甲狀旁腺濾泡旁細胞分泌的一種活性激素，是動物體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝的重要激素之一。CT是強有力的骨吸收拮抗劑，破骨細胞上存在其受體，CT在幾分鐘內(nèi)能迅速抑制破骨細胞的活性，長期則抑制其增殖，使破骨細胞數(shù)量減少，從而抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換，以降低血鈣磷含量，對骨有保護作用（曹國凡等，2008）[15]。血 Ca2+是影響 CT分泌的主要因素，與 CT含量呈正相關(guān)。本試驗結(jié)果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CT含量呈一定的一次線性降低趨勢，但關(guān)于其影響機理尚不清楚，相關(guān)的研究報道也少見。閆素梅等（2007）[2]的前期研究結(jié)果得出，隨日糧維生素A水平的增加，血清鈣含量呈顯著的一次線性降低趨勢，與本試驗結(jié)果相吻合。提示，過量維生素A引起血清CT濃度降低與血鈣含量的降低有關(guān)。提示，過量維生素A可降低血清CT的含量，與血鈣含量的降低有關(guān)，即過量維生素A引起血清CT含量的降低是鈣代謝紊亂的一種適應調(diào)節(jié)。

PTH是調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)換及骨骼鈣磷代謝的最為重要的肽類激素之一。池肇春（1984）[16]研究報道，PTH的分泌及進入血液循環(huán)主要受血漿Ca2+濃度的調(diào)節(jié)，血鈣含量低于正常水平促進PTH分泌，高于正常則抑制其分泌。閆素梅等（2007）[2]的研究結(jié)果得出，隨日糧維生素A水平的增加，血清鈣含量呈顯著的一次線性降低趨勢。本試驗結(jié)果表明，隨著日糧維生素A水平的增加，血清PTH含量呈顯著的一次線性增加（P=0.029）；提示，過量維生素A引起血清PTH的濃度降低與血鈣含量的降低有關(guān)，即過量維生素A引起血清PTH含量的增高是鈣代謝紊亂的一種適應調(diào)節(jié)。

維生素D3必須經(jīng)過兩次酶促羥化階段轉(zhuǎn)化成為1，25-（OH）2D3才能具有生物活性。1，25-（OH）2D3在腸道、腎臟及骨骼中均具有調(diào)節(jié)鈣磷水平的重要作用（朱建軍等，2009）[17]，通過激活鈣磷離子在腸上皮細胞的主動轉(zhuǎn)運，增加鈣磷吸收，提高血液鈣磷水平，保證骨骼正常鈣化。一些研究表明，過量維生素A對維生素D具有拮抗作用，維生素A到達消化吸收部位前，部分損壞維生素D，干擾了維生素D3的正常吸收和代謝(Metz等，1985；Veltmann 等，1985)[18-19]。金久善等（1994）[7]的研究指出，乳牛口服大劑量的維生素A造成骨骼鈣磷代謝的紊亂，與過量的維生素A對維生素D3的拮抗作用有關(guān)，結(jié)果表明，大劑量維生素A組的乳牛維生素D3的活性代謝產(chǎn)物25－羥維生素D3和1，25－二羥維生素D3的生成減少，進而影響鈣磷代謝。本試驗結(jié)果表明，隨日糧維生素A水平的增加，血清維生素D3含量呈一定的一元二次降低趨勢，進一步驗證了過量維生素A對維生素D的拮抗作用。由此推斷，過量維生素A可能通過抑制維生素D的吸收，引起維生素D3水平的降低，進而影響鈣磷的轉(zhuǎn)運和骨骼的鈣化，導致肉雞鈣磷代謝紊亂。

3.2 日糧維生素D對肉雞血清CaBP、BGP、CT、PTH及維生素D3含量的影響

王松艷等（1999）[20]研究報道，缺乏維生素D的日糧可引起肉雞體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物減少，血清鈣磷含量降低，骨重吸收增加，骨密度、骨礦含量、股骨重等均低于正常組。閆素梅等（2007）[2]研究結(jié)果表明，日糧維生素D水平在500～5 000 IU/kg范圍內(nèi)，隨著日糧中維生素D添加劑量的增加，血清鈣磷含量呈一次線性增加趨勢，脛骨鈣含量呈顯著的一元二次曲線上升趨勢。本試驗結(jié)果表明，日糧維生素D水平對肉雞血清BGP及維生素D3水平的影響呈一定劑量依賴性，隨日糧維生素D水平的增加，血清活性維生素D3含量呈趨于顯著的一次線性增加趨勢（P=0.093），血清BGP含量呈現(xiàn)一次線性增加趨勢(P=0.14)，提示高劑量的維生素D水平對過量維生素A有弱的拮抗作用，可以緩解過量維生素A對骨骼代謝產(chǎn)生的不利影響。Metz等（1985）[6]的研究指出，給幼齡火雞飼喂大劑量維生素A和正常劑量的維生素D3以后,火雞出現(xiàn)類似佝僂病的癥狀；但在給火雞飼喂大劑量維生素A的同時，飼喂大劑量的維生素D3，火雞的骨骼生長基本正常，提示維生素D對維生素A具有一定拮抗作用，與本試驗結(jié)果相似。

本試驗結(jié)果也得出，日糧維生素A水平在1 500～45 000 IU/kg范圍內(nèi)，維生素D水平在500～5 000 IU/kg范圍內(nèi)，維生素A、D交互作用對肉雞血清CaBP、BGP、PTH、CT及維生素D3含量的影響均不顯著，但是相關(guān)的研究報道很少，確切的結(jié)果還有待于進一步的研究探討。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，初步得出以下結(jié)論：

① 45 000 IU/kg維生素A組血清BGP含量最低，有顯著低于1 500 IU/kg維生素A組的趨勢(P=0.08)。日糧維生素A水平在1 500～45 000 IU/kg范圍內(nèi)，隨著日糧維生素A水平的增加，血清CaBP含量呈趨于顯著的一次線性降低趨勢（P=0.092），維生素D3含量與CT濃度也呈一元二次降低趨勢（P=0.12）及一次線性降低趨勢（P=0.18），其中，以 15 000、45 000 IU/kg維生素A組較低，尤以45 000 IU/kg維生素A組最低，血清PTH含量呈顯著的一次線性增加（P=0.029）。

②日糧維生素D水平在500～5 000 IU/kg范圍內(nèi)，隨著日糧維生素D水平的增加，血清維生素D3含量呈趨于顯著的一次線性增加趨勢（P=0.093），血清BGP濃度也呈一次線性增加趨勢（P=0.14）；其中，以2 500和5 000 IU/kg時較高，5 000 IU/kg時最高。

③過量維生素A引起的肉雞骨骼鈣磷代謝發(fā)生障礙與血清CaBP含量的降低及PTH濃度的增加有關(guān)，也與過量維生素A對維生素D的拮抗作用有關(guān)。

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