不同形式蛋氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性的影響

遲淑艷 譚北平 楊奇慧 董曉慧 劉泓宇

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088)

蛋氨酸在肝細(xì)胞內(nèi)和三磷酸腺苷（ATP）通過(guò)蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（Methionine adenosyl transferase，MAT）催化形成具有活性甲基的S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl Methionine,SAM），從而在體內(nèi)參與諸多合成和分解代謝的化學(xué)反應(yīng)，MAT是該反應(yīng)的限速酶，屬胞內(nèi)酶。蛋氨酸是凡納濱對(duì)蝦的第一限制性氨基酸，但是，晶體蛋氨酸和微膠囊化的蛋氨酸哪種能更有效地被動(dòng)物吸收、利用還不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加晶體蛋氨酸和微膠囊蛋氨酸，通過(guò)放射性同位素檢測(cè)方法，研究不同形式的蛋氨酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性的影響，以期為晶體氨基酸在對(duì)蝦飼料中有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

配制5種等氮、等能的低魚(yú)粉飼料（表1）。缺乏的蛋氨酸分別添加晶體L-蛋氨酸（MET,Adisseo，法國(guó)）、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(Fluka,美國(guó))包被蛋氨酸(CAP)、棕櫚酸甘油酯（Fluka，美國(guó)）包被蛋氨酸(TPA)、樹(shù)脂（Eudragit П,元升工業(yè)，江蘇連云港）包被蛋氨酸(RES)、羥基蛋氨酸（MHA,Alimet,Novus Internation?al,Inc.上海）5種形式，其中以MET為對(duì)照組。將所有粉碎好的飼料原料(過(guò)60目篩)按飼料配方(表1)混合均勻，經(jīng)雙螺桿制粒機(jī)[F-26(Ⅱ)，華南理工大學(xué)監(jiān)制]擠壓成直徑1.5 mm的條狀，在60℃恒溫下烘干至水分為10%左右，破碎，封裝備用。各處理組飼料氨基酸含量見(jiàn)表2。

表1 飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分(%干物質(zhì))

表2 飼料中氨基酸含量(%)

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在粵海飼料東海島試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，選擇健康凡納濱對(duì)蝦蝦苗，投喂商業(yè)飼料暫養(yǎng)2周后隨機(jī)選擇600尾健康對(duì)蝦進(jìn)行分組。共5個(gè)處理組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)40尾蝦[初始重(0.81±0.01)g]于300 L玻璃鋼養(yǎng)殖桶中，每天投喂4次，飽食投喂，時(shí)間7：00、11：00、18：00、21：00，每天記錄投餌量，根據(jù)查餌情況變動(dòng)投喂量，每次投喂前虹吸除去殘餌和蛻掉的殼。養(yǎng)殖期間24 h供氧，溶解氧10.45～10.5 mg/l，水溫29～30 ℃，pH值7.8～8.0，養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)50 d。

1.3 樣品收集及化學(xué)分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)進(jìn)行到28 d和50 d時(shí)，分別于7：00投料攝食后0.5、1、3、6、12 h進(jìn)行肝胰腺取樣，以蒸餾水為介質(zhì)進(jìn)行勻漿，1×104r/min離心取上清液，測(cè)定蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性（MAT）（檢測(cè)方法由美國(guó)田納西大學(xué)外科學(xué)院Malak Kotb老師和他的學(xué)生Ramy Attia提供），具體方法如下：取10 μl、5×緩沖液（250 mmol/l TES緩沖液，250 mmol/l KCl，75 mmol/l MgCl2，1.5 mmol/l EDTA，0.5 mg/ml BSA溶液），5 μl 50 mmol/l ATP，1 μl 1 mmol/l14C-L-蛋氨酸（經(jīng)由中國(guó)同位素公司購(gòu)自Amersham），0.2 μl、1 mol/l DTT，加入去離子水，將混合物在37 ℃孵育5 min，取40 μl放入10 μl樣本中反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后分別取管中溶液20 μl，點(diǎn)樣在經(jīng)冰醋酸處理的2 cm2的P81離子交換紙，在大容器中（4 L）流水沖洗30 min，上液閃儀（Packard,Tri-carb 2900TR,Liquid scitillation analyzer）測(cè)定14C-L-蛋氨酸放射活性。MAT活性的測(cè)定在廣州中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院放射核醫(yī)學(xué)教研室完成。

2 結(jié)果分析

養(yǎng)殖第28 d、第50 d攝食不同形式氨基酸凡納濱對(duì)蝦肝胰腺M(fèi)AT活性見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 養(yǎng)殖第28 d攝食不同形式蛋氨酸后12 h內(nèi)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性

由圖1看出，養(yǎng)殖試驗(yàn)進(jìn)行到第28 d時(shí)，攝食后0.5 h時(shí)CAP處理組MAT活性最高，1 h時(shí)RES處理組MAT活性上升至最高，而0.5 h和1 h時(shí)，TPA處理組均保持最低；3 h時(shí)RES組回落而TPA組和CAP組上升，并且TPA組在6 h時(shí)升至最高后于12 h時(shí)回落。MET組在0.5、3 h和6 h時(shí)MAT活性均較低，但是在12 h時(shí)驟然升高，不僅高于其他各組，還高于該組在整個(gè)取樣點(diǎn)時(shí)的MAT活性。MHA處理組在3 h時(shí)MAT活性最高。

圖2 養(yǎng)殖第50 d攝食不同形式蛋氨酸后6 h內(nèi)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性

在養(yǎng)殖第50 d時(shí)，凡納濱對(duì)蝦攝食不同形式蛋氨酸飼料6 h內(nèi)，MAT活性發(fā)生了變化。攝食后0.5 h時(shí)，MET和MHA組的MAT活性較高，到1 h時(shí)3個(gè)微膠囊組的MAT活性開(kāi)始上升而MET組下降，RES組上升較緩慢；3 h時(shí)RES組MAT活性持續(xù)上升，且達(dá)到觀察期內(nèi)的最高點(diǎn)，6 h時(shí)RES組MAT活性回落至最低，而此時(shí)MET組的MAT活性卻突然上升至最高。MHA處理組在0.5、1和3 h時(shí)始終保持較高的MAT活性，在6 h時(shí)有所下降。

3 討論

水生動(dòng)物飼料中魚(yú)粉蛋白源被部分或全部替代后，會(huì)導(dǎo)致氨基酸的缺乏，通過(guò)添加晶體氨基酸(CAA)可以彌補(bǔ)限制性氨基酸的不足，同時(shí)提高蛋白質(zhì)的利用效率，改善凡納濱對(duì)蝦(Penaeus vannamei)[1]、日本對(duì)蝦(Penaeus japonicus)[2]、羅非魚(yú)(Tilapia nilotica)[3-4]、虹鱒 (Salmo gairdnerii Richardson)[5]、斑 點(diǎn) 叉尾 鮰(Ictal?urus punctatus)[6-7]、鯉魚(yú)(cyprinus carpio)[8]和尖吻鱸(Lates calcarifer Bloch)[9]等動(dòng)物的生長(zhǎng)。然而，水生動(dòng)物利用晶體氨基酸的效果并非一致。有研究指出，動(dòng)物腸道吸收CAA的速度比吸收肽和蛋白質(zhì)要快[10-12]，導(dǎo)致由飼料來(lái)源的蛋白分解出的游離氨基酸利用效率降低，部分氨基酸分解作用加劇[13]。有關(guān)CAA在動(dòng)物體內(nèi)代謝程度的研究較少，Segovia-Quintero等通過(guò)飼喂尼羅羅非魚(yú)含放射性35S的蛋氨酸結(jié)果表明，蛋氨酸在整個(gè)腸道都有吸收，在前腸吸收最高[14]。

蛋氨酸吸收入血最初在肝臟聚集，首先經(jīng)MAT在ATP的作用下形成SAM，成為體內(nèi)最重要的甲基供體并且參與多種細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖第28 d和第50 d時(shí)的MAT活性間接反映蛋氨酸的吸收速度和代謝程度。結(jié)果表明，養(yǎng)殖試驗(yàn)進(jìn)行至第28 d和50 d時(shí)，攝食后的不同時(shí)間點(diǎn)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺M(fèi)AT活性是有差異的。28 d時(shí)攝食0.5 h時(shí)CAP組的MAT活性最高，并且?guī)追N蛋氨酸添加形式除了TPA微膠囊蛋氨酸組以外均高于MET組，提示晶體蛋氨酸是否在0.5 h內(nèi)已經(jīng)被吸收代謝，也就是說(shuō)在0.5 h以內(nèi)，由于晶體蛋氨酸進(jìn)入消化道后以較高的底物濃度刺激了MAT的活性，使得該處理組在0.5 h時(shí)已經(jīng)過(guò)了該酶活性的最高峰值；而微膠囊蛋氨酸的不同處理均具有一定的緩釋作用，在0.5 h時(shí)CAP組MAT活性最高，已經(jīng)有一定量蛋氨酸釋放被吸收進(jìn)入代謝途徑，分析可能由于包被技術(shù)的原因使該處理組表現(xiàn)出蛋氨酸的突釋，三種微膠囊蛋氨酸的制作工藝是不同的，包被的時(shí)間也不同，導(dǎo)致其釋放的速度以及包被的效果存在差異[15]。1 h時(shí)MET組活性上升提示蛋白結(jié)合態(tài)中的蛋氨酸可能已經(jīng)分解游離出來(lái)，通過(guò)腸道黏膜吸收而使MAT活性上升；第50 d時(shí)0.5 h，MET和MHA處理組的MAT活性較高，提示蛋氨酸已經(jīng)被吸收代謝，到1 h時(shí)三個(gè)微膠囊組的MAT活性開(kāi)始上升，圖2顯示，CAP和TPA處理組微膠囊的蛋氨酸吸收可能快于RES組，RES組MAT活性逐漸上升，3 h時(shí)達(dá)最大，提示此時(shí)RES組的蛋氨酸吸收較高，可能與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)分解出的蛋氨酸同步，并被動(dòng)物較好利用，積極參與了蛋氨酸的代謝過(guò)程。MET組在第28 d攝食后12 h MAT活性最高，在第50 d攝食后6 h MAT活性最高（12 h樣本損壞）提示可能在此時(shí)已經(jīng)完成一個(gè)蛋氨酸循環(huán)并進(jìn)入到下一個(gè)循環(huán)，而此時(shí)蛋氨酸濃度較高致使蛋氨酸形成SAM時(shí)MAT表現(xiàn)出較高的活性。

Segovia-Quintero等認(rèn)為強(qiáng)飼尼羅羅非魚(yú)含有MET和CAP蛋氨酸的飼料后，肝臟35S的活性在1 h和6 h時(shí)顯著增高，并且一直保持到12 h，TPA處理組肝臟中35S放射活性在整個(gè)觀察期內(nèi)顯著低于另外兩個(gè)組，因此，認(rèn)為TPA包被的蛋氨酸吸收速率低于晶體蛋氨酸和CAP包被的蛋氨酸，TPA的緩釋效果好于CAP[14]；本試驗(yàn)中第28 d的結(jié)果顯示，微膠囊處理的三個(gè)蛋氨酸組在12 h的MAT活性均有下降，MET組的MAT活性高于微膠囊處理的三個(gè)蛋氨酸組，以RES組最低，這和前者結(jié)果相似；第50 d時(shí)12 h的樣本損壞，未能獲得此時(shí)的結(jié)果。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)條件下的數(shù)據(jù)表明，生長(zhǎng)過(guò)程中的不同時(shí)期，凡納濱對(duì)蝦對(duì)氨基酸的吸收是存在差異的，微膠囊化對(duì)晶體蛋氨酸的吸收有一定的緩釋作用，可以改善晶體蛋氨酸和蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)蛋氨酸的吸收效率。需要進(jìn)一步優(yōu)化蛋氨酸的微膠囊壁材、包被工藝和了解凡納濱對(duì)蝦機(jī)體蛋氨酸的代謝動(dòng)力學(xué)，在提高蛋氨酸吸收的基礎(chǔ)上改善其代謝效率。

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