定量檢測血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床研究

王雪英

鼻咽癌(NPC)在我國的發(fā)病率較高，多發(fā)于我國南方。而Espstein-barr病毒屬于皰疹病毒科?亞科，已有研究發(fā)現(xiàn)EB病毒與鼻咽癌發(fā)病密切相關(guān)[1],鼻咽癌患者EB病毒感染率明顯高于健康人群。過去常常利用檢測EB病毒的相關(guān)抗體來對(duì)鼻咽癌患者實(shí)施診斷及對(duì)病情變化檢測，但這種方法特異性和敏感性較差。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，使直接對(duì)EBV定量檢測在臨床中得以實(shí)現(xiàn)，且已被廣泛使用。因此，本研究為探討定量檢測血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床意義，現(xiàn)將具體情況報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月～2011年12月在經(jīng)我院病理檢查初診為鼻咽癌患者320例，其中男180例，女140例；年齡最大71歲，最小24歲，平均44.2歲；病理類型：泡狀核癌30例，中分化鱗癌75例，低分化鱗癌215例。健康體檢者290例,男155例,女135例,平均年齡39.4(26～63)。標(biāo)本采集:分別抽取3組受檢者外周血2ml,加入EDTA抗凝管,4000r／min離心,然后吸取上層血漿于-20℃保存待測。

1.2 研究方法 采用熒光定量PCR法血漿檢測EBVDNA含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為德國Roche公司生產(chǎn)的LightCyclerⅡ,標(biāo)本嚴(yán)格按中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的EB病毒(EBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：PCR緩沖50μl，上下游引物和探針各10pmol，dNTP、dCTP、dGTP、dUrP各200pmol／L,Taq聚合酶5μl模板5μl。雙標(biāo)記熒光探針序列5′-(FAM)CTGTCT GTAAAGTCCAGCCTCC(TAMRA)-3′,每批PCR均用雙蒸水作陰性對(duì)照；克隆合成的EB病毒DNA片段作為陽性對(duì)照，并稀釋成不同濃度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增。先將熒光定量PCR擴(kuò)增儀在93℃3min預(yù)變性，然后接93℃45s，55℃2min，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束，用計(jì)算機(jī)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用χ2檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行組間顯著性測試，將P≤0.05定為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 3組EBV-DNA測定結(jié)果及其比較 治療前組陽性率為92.5%,治療后組均經(jīng)隨訪鼻內(nèi)鏡活檢和病理證實(shí)為NPC放療后復(fù)發(fā)陽性率為23.4%；健康對(duì)照組陽性率為3.4%；3組間陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）具體結(jié)果見下表1。

表1 對(duì)照組和治療前后組血漿EVB-DNA檢測結(jié)果比較

2.2 血漿EBV-DNA水平和鼻咽癌嚴(yán)重程度的關(guān)系 在經(jīng)我院病理診斷為鼻咽癌的320例患者中，有淋巴轉(zhuǎn)移的201例，無淋巴轉(zhuǎn)移119例，在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間比較，血漿EVB-DNA檢測陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體結(jié)果見下表2。

表2 鼻咽癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間檢測結(jié)果比較

3 討論

EB病毒是嗜淋巴細(xì)胞的皰疹病毒,屬DNA腫瘤病毒,該種病毒能引起人類的傳染性單核細(xì)胞增多癥,還和T淋巴細(xì)胞瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、鼻咽癌等有關(guān),也可終身潛伏體內(nèi)[2]。雖然不能直接肯定EB病毒就是導(dǎo)致鼻咽癌的病因,但大量科學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在幾乎所有的鼻咽癌細(xì)胞中存在EB病毒,在鼻咽癌細(xì)胞DNA中可以找到被整合的EBV特異性基因片段,說明EB病毒感染和鼻咽癌有密切關(guān)系。目前，臨床上鼻咽癌患者治療前診斷、療效監(jiān)測、局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的診斷，主要依靠影像學(xué)檢查，但影像學(xué)檢查價(jià)格比較昂貴，且有時(shí)對(duì)療效判斷、診斷復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)敏感性較差。主要原因是因?yàn)橐环矫?，CT、MRI等是一種局部顯像技術(shù)，不可能同時(shí)檢測到每一個(gè)可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位；另一方面，傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查在診斷較小的轉(zhuǎn)移處、放療后腫瘤浸潤與纖維化鑒別時(shí)，以及殘存腫瘤性質(zhì)的判斷方面具有一定的局限性[3]。

隨著核酸分子雜交及PCR技術(shù)的發(fā)展,特別是熒光基因探針（FQ-PCR）技術(shù)在臨床的應(yīng)用,為人們研究NPC的病因和診斷方法提供了新的手段。FQ-PCR技術(shù)具有高特異、高靈敏、有效防止污染的優(yōu)點(diǎn),用于檢測病原微生物感染比免疫學(xué)方法檢測抗原和抗體更直接、更準(zhǔn)確[4]。EBV-DNA拷貝數(shù)是患者體內(nèi)的EB病毒數(shù)量。若患者體內(nèi)病毒拷貝數(shù)高,就預(yù)示著該患者病情較為嚴(yán)重[5-6]。本研究通過熒光PCR對(duì)鼻咽癌患者治療前后以及健康體檢者的血漿EBV-DNA含量進(jìn)行定量檢測，發(fā)現(xiàn)治療前組患者血漿EBV-DNA陽性率為92.5%明顯高于治療后組（23.4%）和健康對(duì)照組（3.4%），P＜0.05。治療后組的陽性病例均出現(xiàn)鼻咽癌復(fù)發(fā)，陰性病例沒有復(fù)發(fā)。在有無淋巴轉(zhuǎn)移組間比較，有淋巴轉(zhuǎn)移組的血漿EBV-DNA陽性率明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。這說明鼻咽癌與EB病毒感染密切相關(guān)。

總而言之，血漿EBV-DNA水平對(duì)鼻咽癌的診斷具有重要意義，同時(shí)有可能成為監(jiān)測鼻咽癌患者放療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)記物在鼻咽癌的治療中起重要作用。

[1]李多杰,彭開桂,江浩,等.血漿EBV-DNA定量分析在監(jiān)測鼻咽癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的價(jià)值[J].實(shí)用腫瘤雜志,2008,23(1):12-15.

[2]李群.EB病毒VCA2IgA和EA2IgA抗體與鼻咽癌診斷的關(guān)系[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,13(2):180.

[3]楊德輝.鼻咽癌患者血漿游離EBV-DNA檢測的研究現(xiàn)狀[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊,2006,26(1):1-5.

[4]曾剛毅,唐孝亮,鐘海軍.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測鼻咽癌患者血漿游EB病毒DNA的臨床應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2008,5(10):591.

[5]馮海燕,莫穎禧,周曉瑩,等.鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA水平與腫瘤的分期關(guān)系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外頸外科雜志,2008,22(5):277-278.

[6]熊春娥.鼻咽癌放療的治療及護(hù)理體會(huì)[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2009,15(3):126-127.