BMP-4在肝大部切除大鼠肝再生過程中的作用

楊榮 許翠萍 李曉艷 劉娟 高海晉

隨著肝硬化和肝癌的發(fā)病率的增高，肝臟再生機制的研究也越來越受到人們的關注。肝臟再生過程需要多種信號轉(zhuǎn)導通路的參與，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)信號轉(zhuǎn)導通路是肝再生過程中一條重要的信號轉(zhuǎn)導通路[1]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)BMP-4在正常肝組織中于中央靜脈、匯管區(qū)周圍的肝細胞胞漿內(nèi)中度表達[2]。本實驗選用BMP-4的直接拮抗劑Noggin進行干預，進一步研究BMP-4在肝再生過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 重組鼠Noggin試劑盒購自于美國R&D Systems,Inc.試劑公司，兔抗鼠BMP-4多克隆抗體、即用型SP試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB顯色劑購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝再生模型建立：取成年健康、雄性Wistar大鼠80只，體重180～220g，適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為四組，8只作為正常對照組(NC),余72只制作PH模型，將模型鼠隨機分為生理鹽水組(NS,n=24)、Noggin低劑量組(NL,n=24)和Noggin高劑量組(NH,n=24)。模型鼠各組采用Higgins[3]經(jīng)典方法行PH術, 即腹部正中切口進入腹腔，擠出肝臟的左葉和中葉并于肝蒂部結(jié)扎后切除（切除量約占全肝的68%～70%），術后關閉腹腔前分別給予NS、NL、NH組等滲鹽水（1ml/kg）、Noggin（500ng/kg）、Noggin(2500ng/kg)注射，術后24h、48h腹腔各注射一次直至處死。

1.2.2 標本準備 各組大鼠均于PH前及處死前稱體重，PH術中被切除的肝葉予以稱濕重，術后在各觀察時間點采用1%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉，切除再生肝稱濕重，NC組直接麻醉取肝組織稱濕重。取部分再生肝組織以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片，以供免疫組織化學檢測。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 肝再生率的測定：肝再生率（%）=再生肝重與術后體重之比/術前肝重與術前體重之比×100%[4]。

1.2.3.2 BMP-4免疫組化染色（SP法）:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓熱修1min40s，冷卻后用PBS（pH7.2～7.6）振洗，3%H2O2去離子水孵育15min，蒸餾水浸泡3min,PBS液振洗；滴加封閉用正常山羊血清封閉液，在濕盒中室溫保存15min；甩去多余液體，滴加一抗 BMP-4（1：100），濕盒中4℃孵育過夜；用PBS液振洗后滴加二抗工作液生物素標記山羊抗兔IgG，濕盒中37℃孵育15min；PBS液振洗后滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，濕盒中37℃孵育15min ，PBS振洗；DAB顯色；蘇木素復染；酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.3.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS軟件包（17.0）版，通過方差分析及LSD-t檢驗法對各組及組間進行比較，相關分析采用Pearson直線相關分析法，以P<0.05表示對比組之間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝再生率的測定結(jié)果 三組模型鼠肝再生率在PH術后12～72h間均呈逐漸增高的趨勢，NS組與NL組和NH組在12h時間點組間差異有統(tǒng)計學意義（F=18.976，P<0.01），而NL組和NH組間差異無統(tǒng)計學意義；48h、72h時間點三組間差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 各組肝再生率比較（%,n=8）

2.2 BMP-4免疫組化染色結(jié)果 正常肝組織（NC組，0h）中BMP-4于中央靜脈、匯管區(qū)周圍的肝細胞胞漿內(nèi)中度表達。BMP-4的表達在12h時間點有所降低，三組間差異有統(tǒng)計學意義（F=251.423，P<0.01）；在48h時間點降至最低后開始回升，三組間差異有統(tǒng)計學意義（F=241.995，P<0.01）；72h時間點BMP-4的表達增多但仍小于正常對照組的表達，三組間差異有統(tǒng)計學意義（F=318.637，P<0.01），見表2。

表2 各組BMP-4灰度值比較（n=8）

2.3 再生肝組織中BMP-4的表達與肝再生率相關關系

PH術后NS、NL、NH各組BMP-4灰度值與肝再生率無相關性(rNS=0.169,P＞0.05;rNL=0.350,P＞0.05;rNH=0.218,P＞0.05)。

3 討論

肝臟有著巨大的再生能力，研究證實，肝臟在正常的生理狀態(tài)下0.0012%～0.01%的細胞進行有絲分裂，當肝臟被部分切除或受到某些化學物質(zhì)損傷后，殘存的肝組織便立即再生，當肝臟再生達到其重量是個體體重的一定比例時，肝再生便自動停止[5]。肝再生過程包括肝實質(zhì)細胞和肝非實質(zhì)細胞的再生，肝實質(zhì)細胞在70%肝大部切除術后10h開始合成DNA，于24h達第一個合成高峰，于48h達第二個合成高峰，而肝非實質(zhì)細胞在70%肝大部切除術后24h開始合成DNA，48h DNA合成達到高峰[6-7]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein ,BMP)具有多種功能，近年來研究發(fā)現(xiàn)，BMP在肝臟的再生過程中起著重要的作用。而Noggin是BMP信號的直接拮抗劑，其直接拮抗BMP-4，對 BMP-4的拮抗作用呈劑量依賴性，且二者之間的作用具有線性量效關系[8-9]。Sanong[10]研究認為，通過BMP-4的過度表達可以加速肝細胞分化形成早熟肝索，而使用拮抗劑Noggin阻斷BMP信號，可以減慢這個過程。

本實驗通過外源性Noggin的干預，采用免疫組化染色的方法觀察 BMP-4在大鼠再生肝組織中的表達情況。BMP-4的表達在PH術后12h開始下降，考慮可能是與BMP-4在肝組織損傷初期對肝組織損傷有一定的修復作用有關。而PH術后各組BMP-4灰度值與肝再生率無相關性。由此可見，雖然BMP-4的表達趨勢與肝再生率無相關性，但 BMP-4在PH術后48h時間點出現(xiàn)明顯下降，72h時間點出現(xiàn)回升的趨勢與PH術后肝非實質(zhì)細胞再生動力學時間點恰好一致，由此推測BMP-4可能參與調(diào)節(jié)肝非實質(zhì)細胞增殖、肝索形成及肝臟的塑形的過程。在PH術后各時間點不同濃度的Noggin對肝再生過程中BMP-4的拮抗作用不同，這可能與Noggin拮抗BMP-4的作用呈劑量依賴性有關。

以上是對BMP-4在外源性Noggin干預下對肝再生過程影響的研究，本研究通過外源性Noggin的干預，證明BMP-4在肝再生過程中起修復肝組織損傷和調(diào)節(jié)作用，可能參與肝非實質(zhì)細胞、肝索形成及完成肝臟塑形的過程，其確切機制尚需進一步研究。

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