大黃水提物對雄性小鼠睪丸影響的實驗研究*

胡曉丞，李亞洲，高 沖，佟繼銘，張樹峰

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

大黃為臨床常用中藥之一，為廖科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim Ex Balf)或藥用大黃(Rheum officinale Bail)的干燥根及根莖，味苦、性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)[1]?，F(xiàn)代研究表明，大黃含有蒽醌類、多糖類、鞣質(zhì)類等成分，具有瀉下、收澀、止血、抗菌、抗病毒、延緩衰老等作用[2]。據(jù)統(tǒng)計，約有800多種中藥制劑中含有大黃，一般認為大黃毒性較低，臨床應(yīng)用比較安全。但大多數(shù)降脂減肥、排毒養(yǎng)顏類中成藥也含有大黃，以致應(yīng)用大黃的時間過長，導(dǎo)致大黃相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生率增高[3]。有文獻報道，大黃可使小鼠及金黃地鼠睪丸精曲小管上皮的生精細胞發(fā)生斷脫，金黃地鼠和大鼠的性器官萎縮[4-5]。但未見大黃對性器官的毒性反應(yīng)與應(yīng)用大黃劑量關(guān)系的報道。本研究采用竹梅等[6]的方法對大黃產(chǎn)生的生殖毒性與劑量之間的關(guān)系進行實驗研究，為臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 大黃，安國市長安中藥材有限公司，批號:20090902，經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉翠哲研究員鑒定為掌葉大黃的干燥根莖。STP120自動組織處理機、171型組織自動包埋機，美國Thermo Electron Corporation;TK-218型恒溫攤片烤片機，湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司。

1.2 實驗動物分組及處理 清潔級8周齡雄性昆明種小鼠40只，購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，許可證號:SCXK(津)2009-0001。40只小鼠隨機分為空白對照組和大黃大、中、小劑量組，每組10只。大黃大、中、小劑量組小鼠分別給予2、1、0.5g/kg生藥量的大黃水提物灌胃，連續(xù)30d。

1.3 大黃水提取物的制備 大黃藥材粉碎為粗粉，10倍水浸泡兩次，合并提取液，過濾，40℃濃縮至生藥量含量為0.2g/ml備用。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 觀察小鼠一般狀況:觀察給藥期間實驗小鼠的活動、步態(tài)、行為等一般狀況;分別于給藥前、后測量小鼠體重(g)，觀察小鼠體重增長情況:體重增長(%)=(用藥后體重-用藥前體重)/用藥前體重。

1.4.2 計算睪丸指數(shù):小鼠用藥結(jié)束稱重后處死剖取雙側(cè)睪丸，冷生理鹽水沖洗除去血液，濾紙吸干，稱重(帶附睪)，并計算睪丸指數(shù):睪丸指數(shù)(%)=雙側(cè)睪丸(帶附睪)重量/體重[7]。

1.4.3 觀察睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu):睪丸稱重后10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4μm，HE染色觀察睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)并攝片。

1.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 空白對照組小鼠未出現(xiàn)水樣便，活動敏捷，步態(tài)、行為及對外界反應(yīng)情況均正常，未見死亡。大黃大、中、小劑量組小鼠均出現(xiàn)水樣便，其中大劑量組水樣便最為嚴(yán)重、小鼠反應(yīng)略減遲緩，3周后水樣便情況緩解，三組均未見死亡。大黃三個劑量組小鼠體重增長百分率均明顯低于空白對照組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);大黃三個劑量組之間比較，大劑量組小鼠體重增長率與小劑量組、中劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。見附表。

附表 大黃水提物對小鼠體重和睪丸指數(shù)的影響(n=10±s)

附表 大黃水提物對小鼠體重和睪丸指數(shù)的影響(n=10±s)

與空白對照組比較:*P＜0.01，**P＜0.05;與大劑量組比較:#P＜0.01，##P＜0.05

組別 體重 睪丸指數(shù)(%)初始體重(g) 結(jié)束體重(g) 體重增長(%)空白對照組 21.60±1.26 34.49±3.27 0.37±0.07 1.07±0.09大黃小劑量組 23.20±1.99 29.86±3.03 0.22±0.07*## 1.07±0.15##大黃中劑量組 20.80±1.14 30.29±1.91 0.30±0.05**# 0.86±0.17*#大黃大劑量組 22.20±2.30 25.55±1.84 0.13±0.09* 0.94±0.11**

2.2 大黃水提物對小鼠睪丸指數(shù)的影響 大黃中、大劑量組小鼠的睪丸指數(shù)明顯低于空白對照組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);大黃三個劑量組之間比較，大劑量組小鼠睪丸指數(shù)明顯低于大黃小劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見附表。

2.3 小鼠睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu) 對照組小鼠睪丸間質(zhì)細胞形態(tài)正常，生精小管基膜連續(xù)、完整，各級生精細胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，支持細胞形態(tài)典型(附圖A)。大黃小劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細胞仍可見，生精小管基膜開始出現(xiàn)斷裂，各級生精細胞仍可見(附圖B);中劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細胞部分消失，生精小管基膜大部分出現(xiàn)斷裂，生精小管管腔不規(guī)則，生精細胞排列紊亂，生精細胞層數(shù)減少，細胞結(jié)構(gòu)不清(附圖C);大劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細胞完全消失，生精小管基膜斷裂或缺失，生精細胞部分消失(附圖D)。

附圖 小鼠睪丸HE染色結(jié)果(×100)

3 討論

大黃為中醫(yī)臨床常用藥，由于近年來的不當(dāng)使用，不良反應(yīng)發(fā)生率明顯增高，本研究旨在觀察大黃對雄性小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響及與用藥劑量的關(guān)系。

睪丸是雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分，其生精小管的管壁有不同發(fā)育階段的各級生精細胞按順序排列，分別為精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和分化中的精子，直至成熟精子脫離支持細胞(Sertoli細胞)進入管腔。睪丸的功能主要包括兩個方面，一是精曲小管上皮產(chǎn)生精子，二是間質(zhì)細胞分泌雄性激素—睪酮。睪酮的主要作用是促進雄性生殖器官的發(fā)育和第二性征的形成;另外，睪酮還對精子發(fā)生、精子成熟以及體內(nèi)物質(zhì)代謝起一定的作用;同時，睪酮還可以通過刺激中樞維持正常性欲。如果睪丸萎縮，可引起睪丸生精功能障礙，出現(xiàn)少精子癥或無精子癥，造成男性不育;睪丸萎縮還可使睪酮水平降低，必然會影響性欲和性功能。睪丸指數(shù)的變化可較好反映藥物對睪丸毒性的總體情況，也是尋找藥物毒性作用靶器官的重要線索[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃中劑量組、大劑量組小鼠睪丸指數(shù)明顯低于空白對照組，說明大黃生殖毒性確實存在，且靶器官可能是睪丸。本研究HE染色結(jié)果表明，大黃對睪丸間質(zhì)細胞的損害較重，且各劑量大黃對間質(zhì)細胞的損害程度不同，中、大劑量尤為明顯。本研究證明大黃水提物對小鼠睪丸確實存在毒性損傷，為進一步確定大黃毒性作用的靶器官及作用機制的研究提供了實驗依據(jù)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2005版第一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.17-18.

[2]高學(xué)敏.中藥學(xué)(上冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2009.595-607.

[3]曹俊嶺，孫玉琦，肖小河，等.對大黃“毒性”的認識與思考[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，2(2):112-114.

[4]苗明三，王燦.中藥對生殖系統(tǒng)毒性的研究分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):284-285.

[5]沈丕安.中藥不良反應(yīng)與臨床[M].第1版.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2007.275-276.

[6]竹梅，張會軍，王莎莉.青蒿水提物對雄性小鼠一般生殖毒性的實驗研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，35(7):1029-1031.

[7]王心如.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.119.

[8]劉雁，吳純啟，施暢，等.新藥生殖毒性實驗規(guī)范性操作介紹[J].藥物評價研究，2010，33(1):19-21.

[9]張才田，王雪松，胡雪玲，等.雷公藤多苷抑制大鼠精子發(fā)生的研究[J].南京生殖醫(yī)學(xué)雜志，2008，17(2):118-122.