黃瓜雌性性狀的QTL定位分析

厲建梅，辛 明，秦智偉，武 濤，周秀艷

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

黃瓜（Cucumis sativus L.）在自然群體中存在純雌株、強雌株、純雄株（或強雄株）、雌雄同株、純?nèi)?、雌全雄同株、全同株、雌雄全同株?種不同的性型[1-2]，其性別類型復(fù)雜多樣，被認(rèn)為是研究植物性別決定的經(jīng)典模式植物。黃瓜全雌性是保護(hù)地黃瓜品種選育中重要的目標(biāo)性狀，而且利用全雌性品系配制一代雜種無需人工去雄，可極大地簡化雜交種的生產(chǎn)程序。有關(guān)黃瓜雌性性狀分子標(biāo)記已有相關(guān)報道，時秋香等獲得與黃瓜性別決定基因M緊密連鎖的三個共顯性標(biāo)記：SSR19914、SSR23487、SCAR123，其中 SSR19914與SCAR123位于M基因同側(cè)，與M基因遺傳距離分別為3.2和0.94 cM，SSR23487位于M基因另一側(cè)，與M基因遺傳距離為0.28 cM，從而最終將M基因定位于1.22 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)[3]。苗晗等利用F9代RILs群體進(jìn)行復(fù)雌花QTL定位分析[4]。共檢測到8個控制復(fù)雌花性狀的QTL，分布在第1、2、3、6、7染色體上。位于第3染色體的Mp3.2貢獻(xiàn)率最大；位于第6染色體的Mp6.2在春秋兩季位置都很穩(wěn)定。獲得緊密連鎖（＜10 cM）的特異標(biāo)記（SSR04635、 SSR13466、 SSR00584、 SSR10449）4個。

本試驗參照已構(gòu)建的黃瓜高密度遺傳圖譜[5]，試圖找到更多與黃瓜雌性性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期為開展黃瓜雌性性狀研究和分子輔助選擇育種提供技術(shù)支持，為黃瓜雌性系和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供，包括有雌性系P1（D0420）、強雄株系P2（D06103）、組合“D0420×D06103”及組合“D0420×D06103”構(gòu)建的 F2、B1、B2群體，所得的6 個參試世代為 P1、P2、F1、F2、B1、B2。

1.2 試驗方法

試驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實驗實習(xí)基地溫室內(nèi)進(jìn)行。親本材料于2009年3月1日播種育苗，4月15日定植于日光溫室，兩行區(qū)，株行距35 cm×60 cm，每區(qū)定植36株，常規(guī)管理。

2009年7月初采收的F1組合種子熱處理后，于7月15日播種育苗。8月15日定植，每區(qū)定植36株。將其F1組合D0420×D06103自交獲得F2代，并將F1世代分別與兩個親本回交，獲得（D0420×D06103）×D0420和（D0420×D06103）×D06103兩個回交世代。2010年3月2日春播種6個世代，4月18日定植。

1.3 性型調(diào)查

性型調(diào)查樣本容量：每個親本15株，F(xiàn)1組合45株，F(xiàn)2202株、B174株、B279株。

黃瓜花性型調(diào)查方法：當(dāng)植株長到10節(jié)以上時，統(tǒng)計10節(jié)以下每節(jié)所開花的性型，當(dāng)植株長到20節(jié)以上時，統(tǒng)計10～20節(jié)每節(jié)所開花的性型，植株長到30節(jié)以上時，統(tǒng)計20節(jié)以上每節(jié)所開花的性型。雌花節(jié)率：結(jié)果盛期，主蔓上著生雌花的節(jié)位數(shù)占總節(jié)位數(shù)的百分率[6]。雌花節(jié)率（%）＝主莖25節(jié)內(nèi)雌花節(jié)數(shù)+雌雄混合節(jié)數(shù)/25節(jié)×100%。

1.4 DNA提取及近等基因池的構(gòu)建

黃瓜葉片總DNA提取采用CTAB法[7]，略有改動，提取的DNA在含有0.5 μg·mL-1EB的1%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，UVP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄；從F2分離群體中選取雌花節(jié)率處于兩個極端的各10個單株的DNA，將同類型單株的DNA進(jìn)行混合，構(gòu)建全雌、強雄基因池用于篩選在親本中有多態(tài)性的標(biāo)記。

1.5 PCR反應(yīng)及其電泳檢測

SSR 反應(yīng)體系為 20 μL，其中含有 11.3 μL ddH2O，2.0 μL 10 ng·μL-1的模板，0.25 μL 10 pmol·μL-1的引物，2.0 μL 2.5 mmol·L-1的 MgCl2，2.0 μL 10×buffer，2.0 μL 2 mmol·L-1dNTP， 0.2 μL 2.5 U·μL-1Taq DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性6 min；94℃變性30 s；56℃（因引物而異）退火1 min；72℃延伸1 min；35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳、銀染和記錄帶型。

1.6 連鎖分析

分子標(biāo)記的記錄采用常規(guī)的Mapmaker軟件記錄方法—ABH法。父本型D06103的純合帶型記為A，母本型D0420的純合帶型記為B，兩親本的雜合帶型記為H，數(shù)據(jù)缺失或模糊不清的記為“-”，用卡方檢驗法對統(tǒng)計得到的F2群體中SSR帶型分布結(jié)果進(jìn)行分析。使用Mapmaker/EXP V3.0b遺傳連鎖分析軟件構(gòu)建連鎖群，使用MapChart作圖軟件生成連鎖圖。

1.7 QTL定位

使用Windows QTL Cartographer V2.5遺傳位點構(gòu)圖軟件進(jìn)行QTL定位。將“.map”和“.raw”文件導(dǎo)入軟件，生成“.mcd”格式文件。對“.mcd”文件數(shù)據(jù)采用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL掃描定位，以似然比LR（Likehood ratio）大于11.5，即LOD值大于2.5作為QTL存在的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜雌性性狀遺傳分析

雌性系 P1（D0420）和強雄性系 P2（D06103）雜交、自交及回交6個世代的雌花節(jié)率調(diào)查結(jié)果列入表1。P1、P2雌花節(jié)率的次數(shù)分布具有明顯差異，F(xiàn)1代平均值為80.6%，趨向于雌性系親本P1，即大部分表現(xiàn)強雌株，全雌性對強雄性表現(xiàn)為不完全顯性特征，B1代呈單峰分布，B2及F2代呈雙峰連續(xù)分布，且B2及F2代變異范圍較大，表明控制全雌性狀有主效基因，還存在著微效基因的影響；雌花節(jié)率頻次分布如圖1所示，偏度＝│-0.97│＜1，而峰度Kurtosis＝0.72，表現(xiàn)出偏向兩側(cè)，呈現(xiàn)偏態(tài)分布。

表1 黃瓜組合（D0420×D06103）6世代雌花節(jié)率的次數(shù)分布Table1 Frequency distribution of female flowers proportion in six generations of combination D0420×D06103

圖1 D0420×D06103組合的F2群體雌花節(jié)率次數(shù)分布Fig.1 Frequency distribution of female flowers proportion of F2isolated population of combination D0420×D06103

2.2 多態(tài)性引物的篩選

本研究選用214對SSR引物，通過父本D06103和母本D0420組合的篩選，兩親本間具多態(tài)性的引物為51對，多態(tài)率為23.83%，進(jìn)一步利用這51對引物對全雌和強雄2個基因池篩選，得到21個多態(tài)性引物標(biāo)記，6%變性聚丙烯酰胺凝膠篩選結(jié)果見圖2。

2.3 黃瓜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

SSR為共顯性標(biāo)記，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，每個多態(tài)性標(biāo)記在F2群體中的分布均應(yīng)符合1∶2∶1的理論值，基因頻率均應(yīng)符合1∶1的期望比。對獲得的21個多態(tài)性位點在F2群體的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行X2適合性檢測，由卡方檢驗結(jié)果可知，3個標(biāo)記帶型分布出現(xiàn)了偏分離（CSWCT13Balt、CSWCT17、SSR23265、SSR29622），比率為14.29%。對獲得的21個多態(tài)性標(biāo)記位點進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖，其中20個標(biāo)記位點進(jìn)入4個連鎖群（LOD≥2.5），1個位點（CSWCT11）未定位到連鎖群上，連鎖群總長度為98.5 cM，標(biāo)記間平均距離4.9 cM，最短的連鎖群0.5 cM（LG1），最長的連鎖群53.4 cM（LG2）；標(biāo)記間最小距離0.2 cM，最大距離25.2 cM，標(biāo)記總體在整個連鎖群中分布比較均勻，沒有標(biāo)記聚集在一起的現(xiàn)象。用MapChart軟件生成連鎖群如圖3所示。

圖2 引物SSR11633在F2群體中SSR擴(kuò)增產(chǎn)生的帶型Fig.2 SSR amplification results generated by prmier SSR11633 in the F2population

圖3 使用D0420×D06103的F2群體構(gòu)建的遺傳連鎖群Fig.3 Linkage group based on the F2population from the cross D0420×D06103

2.4 黃瓜雌性性狀的QTL定位

用Windows QTL Cartographer V2.5軟件以復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL分析，在連鎖群LG3共檢測出2個與黃瓜性狀相關(guān)的QTL（QTL1，QTL2）：SSR00134-QTL1-SSR18956、SSR15482-QTL2-SSR21936（見表2）。QTL1距離標(biāo)記SSR00134較近，為2.1 cM，LOD值為50.04，可解釋15.36%的表型變異；QTL2距離標(biāo)記SSR21936較近，為1.4 cM，LOD值為6.48，可解釋5.69%的表型變異。QTL位點加性效應(yīng)值分別為0.38和0.12，對提高黃瓜雌性性狀來說表現(xiàn)為增效加性效應(yīng)。QTL在目標(biāo)連鎖群上的位置如圖4所示。

表2 黃瓜雌性性狀QTL分析Table2 QTL analysis of gynoecious in cucumber

圖4 黃瓜雌性QTL定位Fig.4 QTL localization of gynoecious of cucumber

3 討論

偏分離是指遺傳標(biāo)記的觀察頻率偏離預(yù)期頻率的現(xiàn)象，對單個位點遺傳標(biāo)記的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行經(jīng)典的X2檢測可以發(fā)現(xiàn)，偏分離是遺傳標(biāo)記的一種普遍現(xiàn)象[9]，并被認(rèn)為是生物進(jìn)化的動力之一。本試驗的F2群體的表型觀察也偏向于雙親，可能是在構(gòu)建群體時，定植的過程中雖然是每一號植株隨機拿取一株，但也可能存在一定的誤差。偏分離機制是非常復(fù)雜的，目前主要歸納為以下幾點：①遺傳搭車效應(yīng)，與配子體選擇基因相連鎖的標(biāo)記位點可能產(chǎn)生偏分離；②在分子標(biāo)記連鎖圖上存在偏分離的熱點區(qū)域（Segregation distortion region，SDR），在這些區(qū)域可能有與偏分離相關(guān)的特定基因；③染色體片段的重組和倒位，造成減數(shù)分裂時期染色體不配對或親和力降低，減少重組率，使連鎖分離產(chǎn)生偏離；④環(huán)境因素、非同源重組、基因轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)座因子等可能引起標(biāo)記位點的偏分離；⑤標(biāo)記位點數(shù)據(jù)缺失導(dǎo)致的偏分離；⑥作圖群體親本某些位點的雜合；⑦群體構(gòu)建過程中的人為選擇也會造成部分偏差等[10-11]。本研究的F2群體的偏分離究竟是受哪些原因的影響，有待于進(jìn)一步深入研究。

SSR技術(shù)被認(rèn)為是構(gòu)建真核生物高度飽和遺傳圖譜的標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)記[12]。本研究檢測得到與黃瓜雌性性狀相關(guān)的QTL位點2個：SSR00134-QTL1-SSR18956、SSR15482-QTL2-SSR21936，距離最近的標(biāo)記分別為2.1和1.4 cM，具有一定的代表性。試驗檢測到的QTL位點距離兩側(cè)標(biāo)記的距離較大，還應(yīng)繼續(xù)開發(fā)、加大引物密度，同時此QTL位點的貢獻(xiàn)率為15.36%和5.69%，說明此位點對黃瓜雌性代表性一般，應(yīng)進(jìn)一步篩選引物，找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記。此外，本試驗采用F2分離群體、214對引物進(jìn)行QTL定位，雖然檢測到了QTL位點，但檢測到的QTL是否是“一致性QTL”尚不能確定，本試驗只進(jìn)行了一個季節(jié)的QTL定位，由于F2群體是暫時性群體，難以用其進(jìn)行重復(fù)性研究，將來的試驗過程中可以采用永久性群體（如重組自交系RIL）進(jìn)行檢驗。

黃瓜雌性性狀與產(chǎn)量密切相關(guān)，但是由于黃瓜的開花結(jié)果期持續(xù)時間長，傳統(tǒng)方法對雌性狀進(jìn)行表型選擇極為耗時。而通過分子標(biāo)記輔助育種，利用與性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，在復(fù)雜的環(huán)境影響中進(jìn)行輔助育種是改良作物復(fù)雜性狀的有效手段[13-14]。在植株生長早期進(jìn)行選擇，則能大大縮短育種周期，提高育種效率。在黃瓜中，F(xiàn)azio等已證明對于側(cè)枝、瓜長徑比和雌花率的分子標(biāo)記輔助選擇是有效的（側(cè)枝：每輪選擇大約0.3個；長徑比：每輪選擇大約增加0.1個單位；雌花比率：每輪選擇增加5.6%～9.8%）[13,15]。選擇其中穩(wěn)定且高貢獻(xiàn)率的位點進(jìn)行進(jìn)一步的MAS試驗將是一項非常有效的工作。本研究中QTL定位結(jié)果為進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，實現(xiàn)雌花優(yōu)良等位基因的快速轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以黃瓜雌性系D0420×強雄性系D06103的211株F2單株為作圖群體，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，得到與黃瓜雌性性狀相關(guān)的標(biāo)記位點21個，分屬4個連鎖群，連鎖群全長為98.5 cM，標(biāo)記間平均距離4.9 cM，最短的連鎖群0.5 cM（LG1），最長的連鎖群53.4 cM（LG2）；標(biāo)記間最小的遺傳距離0.2 cM，最大的遺傳距離25.2 cM；采用復(fù)合區(qū)間定位分析，檢測到與黃瓜雌性性狀相關(guān)的QTL位點2個，均位于第3連鎖群上，距離最近標(biāo)記的遺傳距離分別為2.1和1.4 cM，LOD值分別為50.04和6.48，貢獻(xiàn)率分別為15.36%和5.69%。

[1]梁永宏,李廣林,郭韜,等.黃瓜性型分化的分子機制[J].生命科學(xué),2010,22(11):1177-1183.

[2]譚其猛.蔬菜育種[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1980.

[3]時秋香,劉世強,李征,等.與黃瓜M基因連鎖的三個共顯性標(biāo)記[J].園藝學(xué)報,2009,36(5):737-742.

[4]苗晗,顧興芳,張圣平,等.黃瓜復(fù)雌花性狀QTL定位分析[J].園藝學(xué)報,2010,37(9):1449-1455.

[5]Ren Y,Zhang Z,Liu J,et al.An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome[J].PloS One,2009,4(6):5795.

[6]李錫香,朱德蔚.黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:20-21.

[7]王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京:科學(xué)出版社,2002:743-744.

[8]鄒曉艷.黃瓜性型遺傳規(guī)律及性別決定相關(guān)基因的分布和表達(dá)研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007:1-55.

[9]譚軍.水稻F2群體SSRs連鎖分析及分子標(biāo)記作圖模型研究[D].杭州:浙江大學(xué),2001.

[10]姜樹坤,鐘鳴,徐正進(jìn),等.水稻相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性反應(yīng)體系的建立及其多態(tài)性位點在F2群體中的分離分析[J].中國水稻科學(xué),2007,21(5):464-468.

[11]嚴(yán)建兵,湯華,黃益勤,等.玉米F2群體分子標(biāo)記偏分離的遺傳分析[J].遺傳學(xué)報,2003,30(10):913-918.

[12]辛明,秦智偉,周秀艷.黃瓜植株高度遺傳分析及其分子標(biāo)記[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(5):34-38.

[13]Fan Z C,Robbins M D,Staub J E.Population development by phenotypic selection with subsequent marker-assisted selection for line extraction in cucumber(Cucumis sativus L.)[J].Theoretical and Applied Genetics,2006,112(5):843-855.

[14]Zhu B G,Sun Y R.Inheritance of the four-seeded-pod trait in a soybean mutant and marker-assisted selection for this trait[J].Plant Breeding,2006,125(4):405-407.

[15]Faz Z C,Chung S M,Staub J E.Comparative analysis of response to phenotypic and marker-assisted selection for multiple lateral branching in cucumber(Cucumis sativus L.)[J].Tag Theoretical and Applied Genetics,2003,107(5):875-883.