3種配方處理吉貝插穗生根過氧化物酶（POD）活性變化的研究

高 柱，伍建榕，嚴(yán) 毅，鄭 元，馬煥成*

（1.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌 330029）

山地棉是指在山地上種植具有較好適應(yīng)性，以生產(chǎn)紡織纖維原料為主，具有較高經(jīng)濟(jì)效益的新型天然纖維原料類植物的總稱，包括木棉科（Bombacaceae）部分植物、牛角瓜（Calotropis gigantean L.）、長(zhǎng)生棉（Gossypium peruriaxum）等。山地棉植物的纖維具有中空度高、紡紗強(qiáng)度高、抗菌、光潔等優(yōu)良特性。棉花是重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備物資，我國(guó)近20年來(lái)種植面積下降0.1%，山地棉種植開發(fā)能夠有效緩解棉糧爭(zhēng)地矛盾。木棉纖維中空度高達(dá)86%以上，是人工纖維的2倍，具有光潔、抗菌、輕柔、保暖等優(yōu)點(diǎn)，吉貝[Ceiba pentandra（Linn.）Gaertn.]是山地棉木棉科植物中纖維開發(fā)價(jià)值較高的樹種之一[1-2]。

扦插育苗具有繁殖系數(shù)高、可工廠化育苗等優(yōu)點(diǎn)，是眾多樹種無(wú)性繁殖育苗的首選[3]。林秀香采用沙壤土∶谷殼灰=4∶1基質(zhì)扦插1年生吉貝半木質(zhì)化枝條，以初夏梅雨季節(jié)成活率最高[4]；本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，以純凈河沙扦插吉貝，生根率依次為配方1#＞配方3#＞配方2#（1～3#配方主要成分依次為生根粉、吲哚乙酸和萘乙酸），且均達(dá)到70%以上，但有關(guān)吉貝扦插過程中生理生化指標(biāo)變化規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。過氧化物酶（Peroxidase，POD）普遍存在于植物體內(nèi)，參與多種生理生化過程，與植物不定根的發(fā)生和生長(zhǎng)有密切關(guān)系，在植物細(xì)胞生長(zhǎng)、分化調(diào)節(jié)及發(fā)育進(jìn)程中起著重要作用[5-6]，Garspar等認(rèn)為POD活性可作為插穗生根的標(biāo)志之一[7]。本試驗(yàn)比較了不同專用配方處理對(duì)吉貝插穗生根過程中POD活性變化響應(yīng)規(guī)律，為揭示吉貝扦插生根機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院教學(xué)試驗(yàn)溫室大棚進(jìn)行。該地位于云南省昆明市盤龍區(qū)，地處102°45′16.7″E，25°03′53.9″N，海拔1 959 m。年均溫度15℃，積溫4 522.6℃，最熱月平均氣溫19℃，最冷月平均氣溫8℃；晝夜溫差大，春、冬兩季溫差可達(dá)12～20℃，紫外線強(qiáng)，光照充足，年均日照時(shí)數(shù)2 054 h。干、濕季節(jié)分明，5～10月為雨季，降雨量占全年85%。試驗(yàn)棚內(nèi)最低溫18℃，最高溫48℃，平均氣溫28℃，最高相對(duì)濕度為85%，最低相對(duì)濕度為45%，平均相對(duì)濕度為80%。

2 材料與方法

2.1 插穗選取及制備

試驗(yàn)于2010年3月7日進(jìn)行，選取采穗圃地2年生母樹的當(dāng)年生枝條制穗。將剪取的枝條去除葉片，上切口離芽1.0 cm平切、下切口離節(jié)0.5 cm處斜切，插穗長(zhǎng)20 cm。用石蠟涂抹上切口，剪好的插穗每20根為一捆，用800倍多菌靈溶液浸泡20 min，晾干后備用。

2.2 插床建立及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用配有全光照自動(dòng)間歇噴霧裝置的溫室育苗池育苗，插床長(zhǎng)6 m，寬1.0 m，深40 cm，雙面砌墻水泥面，床底鋪1層10 cm厚的大鵝卵石，上層鋪30 cm純凈河沙。用50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍液消毒后，用薄膜覆蓋，1周后扦插。分別采用專用配方1#、2#、3#處理插穗1 h。完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理80根插穗，3次重復(fù)，清水處理為對(duì)照。扦插深度為穗長(zhǎng)2/3，密度50根·m-2。保持河沙濕潤(rùn)，每周消毒1次（800倍多菌靈和甲基托布津交替使用）。及時(shí)清除枯穗，新葉完全展開后每隔15 d噴1次2‰尿素。扦插后第0、7、14、21、28、35天取樣，每區(qū)隨機(jī)抽取5根插穗，洗凈后，觀察插穗形態(tài)變化，并迅速剝?nèi)〔逅牖? cm內(nèi)韌皮部，超低溫冰箱保存，備用。

2.3 POD活性測(cè)定方法

稱取樣品0.1 g，加少許石英砂和液氮研磨，研細(xì)后加入2 mL磷酸緩沖液研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2 mL磷酸緩沖液分2次沖洗研缽，并入離心管。10 000 r·min-1冷凍離心15 min，上清液即為酶粗提取液。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚染色法，470 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，每分鐘讀數(shù)1次，活性以ΔOD·g-1·min-1表示[8]。

2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行雙變量相關(guān)性和單因素方差分析，制圖采用Excel 2007軟件進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 插穗生根過程外部形態(tài)觀察

3種配方處理吉貝插穗生根外部形態(tài)觀測(cè)結(jié)果表明，扦插第0～7天，下切口皮層、韌皮部、木質(zhì)部開始松動(dòng)，并在木質(zhì)部外圍形成一圈間隙，愈傷組織就在插穗切口形成的間隙處沿韌皮部形成，為乳白色半透明狀（見圖1-A），有些愈傷組織則在髓芯產(chǎn)生（見圖1-B）；第7～14天，愈傷組織繼續(xù)增多，形成白色突起（見圖1-B），此時(shí)認(rèn)為已有根原基分化[3]，隨著扦插時(shí)間的延長(zhǎng)，不定根形成；第14天以后，大量乳白色不定根突破愈傷組織，不定根數(shù)量逐漸穩(wěn)定（見圖1-C）；不定根繼續(xù)伸長(zhǎng)，乳白色不定根逐漸木質(zhì)化，形成灰褐色成熟根系（見圖1-D）。因此，吉貝插穗生根可分為3個(gè)階段：0～7 d為愈傷組織形成期，7～14 d為不定根形成期，14 d以后為不定根伸長(zhǎng)期。

3.2 三種配方處理插穗POD活性變化規(guī)律

由圖2-A、B、C可知，3種配方處理吉貝插穗生根過程中，0～21 d時(shí)POD活性均呈現(xiàn)“升高-下降-升高”趨勢(shì)，與CK趨勢(shì)較相似，其中峰值出現(xiàn)在第14天，大小依次為專用配方3#（55.39 ΔOD·g-1·min-1）、配方 1#（52.29 ΔOD·g-1·min-1）、配方 2#（44.992 ΔOD·g-1·min-1）、 CK（23.96 ΔOD·g-1·min-1），此時(shí)經(jīng)歷愈傷誘導(dǎo)期和不定根形成期，至不定根生長(zhǎng)期，POD活性開始下降。第21～28天，配方1#的POD活性先降后升；配方2#持續(xù)降低，而配方3#則保持上升趨勢(shì)。配方處理吉貝插穗后，能夠顯著提高生根過程中7～21 d時(shí)插穗的POD活性，并促進(jìn)生根。

圖1 吉貝插穗生根過程中的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of Ceiba pentandra cuttings during rooting process

圖2 吉貝插穗生根過程中POD活性變化及相關(guān)性分析Fig.2 Changes of POD activity and correlation analysis in Ceiba pentandra cuttings during rooting process

將3種配方處理吉貝插穗生根率與生根過程中POD活性進(jìn)行相關(guān)性分析（見圖2-D）可知，生根率與不定根形成期（第14天或峰值）的POD活性呈顯著正相關(guān)（P=0.038），相關(guān)系數(shù)r=0.962，而與其他時(shí)期POD活性差異不顯著。說(shuō)明POD活性越大，對(duì)不定根的形成越有利，并最終提高生根率。

3.3 三種配方處理插穗生根期間POD活性變化比較

將圖2-A、B、C數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析表明，三種配方處理后在不同天數(shù)間POD活性變化差異達(dá)顯著水平（見表1），說(shuō)明POD活性與吉貝生根密切相關(guān)。3種配方處理都極大影響POD活性，但同一天數(shù)時(shí)不同配方間差異不顯著，說(shuō)明在吉貝插穗生根過程中，3種配方影響POD活性進(jìn)而促進(jìn)生根有近似的生理作用。

表1 3種配方對(duì)POD活性作用的方差分析Table1 Variance analysis of the effect of three kinds of proprietary formula on POD activity

4 討論與結(jié)論

4.1 配方處理對(duì)吉貝扦插生根階段的劃分

按照不定根在插穗上著生部位不同，可將插穗生根分為皮部生根、愈傷組織生根和混合生根3種類型。吉貝插穗生根先形成愈傷后有不定根，因此，屬于愈傷組織生根型。李明等認(rèn)為易生根的桉樹生根過程可分為愈傷組織誘導(dǎo)期、不定根形成期、新根伸長(zhǎng)期[9]；難生根的四倍體刺槐硬枝扦插生根分為愈傷誘導(dǎo)期、根原基誘導(dǎo)期和不定根表達(dá)與生長(zhǎng)期[3]；草本芍藥不定根形成包括誘導(dǎo)期、表達(dá)期和伸長(zhǎng)期[10-11]。本試驗(yàn)3種配方處理吉貝插穗扦插生根可分為愈傷組織形成期（0～7 d）、不定根形成期（7～14 d）、不定根伸長(zhǎng)期（14 d以后）3個(gè)階段，與前人的研究結(jié)果類似。

4.2 吉貝生根與POD酶活性變化的關(guān)系

POD是一類含鐵卟啉輔基的氧化酶，普遍存在于植物體內(nèi)，其同工酶在植物體內(nèi)具有發(fā)育階段特異性和組織特異性，是一種重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)酶和生根關(guān)聯(lián)酶[12-13]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中有重要作用，對(duì)植物器官形態(tài)建成有特殊作用[14]。在生根過程中，POD多種同工酶中除具有清除活性氧外，也能行使吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的作用氧化IAA，從而降低插穗體內(nèi)IAA濃度，促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)[15-16]。宋金耀等研究認(rèn)為毛白楊嵌合體扦插生根POD活性有2個(gè)峰[17]，扈紅軍等發(fā)現(xiàn)榛子插條生根過程POD活性僅1個(gè)峰[18]，而難生根樹種四倍體刺槐硬枝扦插生根過程中，POD活性持續(xù)呈上升趨勢(shì)[3]，可見POD活性變化的復(fù)雜性及關(guān)聯(lián)度的差異性。本研究發(fā)現(xiàn)，POD活性在吉貝扦插過程中表現(xiàn)出相似的變化響應(yīng)，在生根前兩個(gè)階段，3種配方處理插穗POD活性均呈現(xiàn)“升高-下降”趨勢(shì)，活性增加幅度依次為配方3#、配方1#、配方2#，愈傷組織及不定根形成期POD活性上升，能夠抑制傷呼吸和降低自由基的損傷，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)，并抑制插穗變褐腐爛[16]，POD活性增加是插穗逆境反應(yīng)酶之一。通過相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)，POD活性最高時(shí)與吉貝生根率呈顯著正相關(guān)，POD活性大小與吉貝生根關(guān)系緊密。進(jìn)一步方差分析顯示，在扦插進(jìn)程中POD活性差異顯著，而不同處理間差異不顯著，說(shuō)明POD活性與吉貝插穗生根密切相關(guān)，且配方處理間存在相似的作用，該結(jié)果與黃卓烈等研究結(jié)論相似[19]。此外，過氧化物酶（POD）為吉貝生根重要關(guān)聯(lián)酶，且在愈傷誘導(dǎo)期和不定根形成期需維持較高活性。

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