小型西瓜離體培養(yǎng)技術(shù)研究

王喜慶

（黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，哈爾濱 150069）

西瓜（Citrullus vulgaris）屬葫蘆科，西瓜屬。西瓜組培始于20世紀(jì)70年代，Andrus等1971年首次報道用無籽西瓜下胚軸培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽，建立無籽西瓜無性繁殖系[1]。許智宏等以西瓜頂芽為外植體誘導(dǎo)出叢生芽，并成功地獲得了試管苗[2]，隨后國內(nèi)外很多學(xué)者做了大量研究，涉及外植體的選擇、激素配比、組培苗的馴化及玻璃化的防止方法等[3-6]，并取得良好進(jìn)展。近年來，小型西瓜生產(chǎn)發(fā)展迅速，市場前景良好，經(jīng)濟效益可觀，各育種單位已經(jīng)深入開展小型西瓜育種工作，目前一個重要目標(biāo)是育成無籽小西瓜。采用離體誘變西瓜四倍體，能使加倍、選擇、快繁同時進(jìn)行，并可克服細(xì)胞嵌和體現(xiàn)象，加快小型西瓜育種工作進(jìn)程。但目前對小型西瓜進(jìn)行組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究報道還較少。劉獨臣等以莖尖、子葉等為外植體進(jìn)行小西瓜組培研究工作[7]。西瓜組培受基因型的限制較大，要利用組織培養(yǎng)與化學(xué)誘導(dǎo)相結(jié)合的方式獲得三倍體，必須首先完善小型西瓜的組織培養(yǎng)體系。試驗以子葉為外植體材料，研究小型西瓜組織培養(yǎng)體系，以期為組織培養(yǎng)誘導(dǎo)四倍體，育成無籽小西瓜提供基礎(chǔ)條件和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

黑龍江省農(nóng)科院園藝分院選育的小型西瓜品種龍盛1號的母本H35。

1.2 方法

選取飽滿的小型西瓜種子，去殼后在無菌水中浸泡2 h，用10%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次，然后接種于MS培養(yǎng)基（蔗糖20 g·L-1，瓊脂5 g·L-1）發(fā)芽，28 ℃暗培養(yǎng)1 d，當(dāng)胚根稍露出時，放置培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

當(dāng)子葉展平，但沒有真葉出現(xiàn)時，選取苗齡一致的子葉，將其橫切，分別取近胚軸端和遠(yuǎn)胚軸端，表面向上接入芽分化培養(yǎng)基中，每瓶放5個外植體，每處理5瓶，重復(fù)3次，放置培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基及其制備

①種子萌發(fā)培養(yǎng)基：MS。

②芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA（0.5、1、2、3 mg·L-1）+NAA（0、0.1、0.3、0.5 mg·L-1）。

③ 芽增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA（1、2、3 mg·L-1）+NAA（0、0.1 mg·L-1）。

④ 壯苗培養(yǎng)基：1/2MS+KT（0.1、0.2、0.3 mg·L-1）+IAA（0.01、0.02 mg·L-1）。

⑤ 生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA（0.1、0.3 mg·L-1）或 IBA（0.01、0.02 mg·L-1）。

MS為基本培養(yǎng)基，添加不同的激素，培養(yǎng)基pH 5.8；分裝，121℃滅菌20 min，冷卻備用。培養(yǎng)室溫度保持在（25±2）℃，光照強度保持在3 000 lx，每天光照12 h。

1.3.2 接種與培養(yǎng)

將已消毒種子平放于萌發(fā)培養(yǎng)基上，待子葉展平時切取不帶莖尖的子葉橫切，分別接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；挑選長勢較好、大小均一的叢生芽團(tuán)塊，切成約1 cm×1 cm的小塊，接種到芽增殖培養(yǎng)基上，接種后15 d觀察統(tǒng)計，芽增殖等情況；后再挑選長勢較好、大小均一的小芽接種到壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，接種后15 d，取長勢較好的試管苗接種到生根培養(yǎng)基上，每瓶5株；將分化長出2～3條小根的小苗瓶放置溫室煉苗，出瓶馴化。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體類型對叢生芽誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，西瓜子葉近軸端和遠(yuǎn)軸端部位分化形成叢生芽的能力差異顯著，遠(yuǎn)軸端外植體的叢生芽誘導(dǎo)率最高可達(dá)2.6%；近軸端外植體叢生芽誘導(dǎo)率最高可達(dá)100%。結(jié)果表明，子葉近軸端外植體再生能力強，誘導(dǎo)率高，叢生芽集中在下胚軸和子葉交接處，其他部位沒有芽的分化。這與張全美的研究結(jié)果一致[8]。

表1 外植體類型對叢生芽誘導(dǎo)的影響Table1 Influence of explant type on cluster buds induction

2.2 外源激素濃度對叢生芽分化的影響

將子葉近軸端接在不同處理培養(yǎng)基上，10 d左右外植體下胚軸和子葉的交接處分化產(chǎn)生淡綠色芽點，繼續(xù)培養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)為綠色，15 d后可形成叢生芽。調(diào)查試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同濃度的NAA下，BA濃度越高，對叢生芽形成越多，但當(dāng)BA達(dá)到3 mg·L-1時抑制叢生芽的形成，最佳激素配比為2.0 mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA（見表2），此時誘導(dǎo)率和每個外植體誘導(dǎo)的叢生芽數(shù)分別為100%和6.3個。

2.3 不同激素配比對叢生芽增殖的影響

誘導(dǎo)出的叢生芽在繼代2～3次后，極易玻璃化，所以將基本培養(yǎng)基無機鹽濃度降低，采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，調(diào)整激素濃度，在誘導(dǎo)出的叢生芽中，選取生長健壯的芽團(tuán)，分割成1 cm×1 cm的小塊，轉(zhuǎn)接到不同激素配比的培養(yǎng)基上，15 d后調(diào)查統(tǒng)計增殖情況（見表3）。

表2 不同激素配比對叢生芽分化的影響Table2 Influence of different hormone ratio on multiple shoot clumps differentiation

表3 不同激素配比對叢生芽增殖的影響Table3 Influence of different hormone ratio on multiple shoot clumps proliferation

當(dāng)NAA為0 mg·L-1時，在BA為2和3 mg·L-1的兩種培養(yǎng)基中，叢生芽增殖率較高，無顯著差異。但BA為2 mg·L-1的培養(yǎng)基中，叢生芽顏色濃綠，生長健壯，所以選擇BA為2 mg·L-1、NAA為0 mg·L-1的培養(yǎng)基作為叢生芽的增殖培養(yǎng)基。叢生芽一般15 d左右繼代1次。

2.4 壯苗培養(yǎng)基的確定

由于叢生芽比較弱小，若直接切取叢生芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，不易直接生根，生根后移栽成活率也很低。因此，在叢生芽長到1 cm時，切取生長正常健壯的單芽，接種到壯苗培養(yǎng)基上。兩周后調(diào)查結(jié)果，當(dāng)KT為0.2 mg·L-1、IAA為0.01 mg·L-1時，苗伸長較好，而且玻璃化現(xiàn)象少，壯苗多（見表4）。

2.5 生根培養(yǎng)

當(dāng)苗高1.5～2.5 cm、具3片葉時，轉(zhuǎn)入1/2MS為基本培養(yǎng)基的生根培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)生根。每瓶接種5株小苗，15 d后小苗基部分化出根。調(diào)查試驗結(jié)果，以添加0.3 mg·L-1NAA和IBA的生根效果無顯著差異，但當(dāng)IBA濃度為0.3 mg·L-1時，苗比較健壯（見表5）。

表4 不同激素配比對小西瓜組培苗復(fù)壯的效果Table4 Influence of different hormone ratio on mini-watermelon seedlings of tissue regeneration

表5 兩種生長素和不同濃度對不定芽生根的影響Table5 Influence of two hormones and different concentrations on in vitro shoot rooting

3 試管苗的移栽與管理技術(shù)

當(dāng)試管苗株高達(dá)到5 cm，根長約1.5～2.0 cm時，即可移栽。首先將培養(yǎng)瓶在室溫、適當(dāng)遮蔭的自然光下煉苗7 d，打開瓶蓋再煉苗2 d。出瓶時用鑷子小心取出幼苗，將根部瓊脂洗干凈，栽入穴盤?；|(zhì)采用蛭石∶草炭∶園土＝2∶1∶2，1個月后成活率達(dá)30%。小西瓜組培苗移栽后的管理相對要求較高，水分管理，要做到少量多次，濕度大容易爛苗，空氣濕度要保持在70%，適當(dāng)遮蔭。1個月后新根長出1 cm轉(zhuǎn)入常規(guī)栽培養(yǎng)護(hù)管理。

4 討論與結(jié)論

通過本試驗，掌握小型西瓜叢生芽誘導(dǎo)、叢生芽增殖、分化苗壯苗及生根等不同階段的培養(yǎng)基配方，探討各階段較為理想的培養(yǎng)條件及小西瓜組培苗馴化栽培的最佳基質(zhì)。

4.1 不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響

本試驗預(yù)備試驗階段考察不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響。由于西瓜的種皮較厚，一般都采取剝離種皮后浸種，使用常規(guī)的升汞和酒精消毒，會降低種子萌發(fā)率，所以本試驗采用10%次氯酸鈉消毒10 min，消毒效果較好，污染率極低。

4.2 不同外植體對不定芽誘導(dǎo)的影響

本試驗將4～6 d苗齡的無菌苗子葉分割為近軸端和遠(yuǎn)軸端兩部分分別培養(yǎng)，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)比較試驗,結(jié)果表明子葉近軸端外植體再生能力強，誘導(dǎo)率高。造成這一差異的原因，與植物組織的生長狀態(tài)和組織、器官內(nèi)源激素分布不均有關(guān)。

4.3 利用壯苗培養(yǎng)來提高生根率

由子葉近軸端誘導(dǎo)出的叢生芽成簇狀，叢生芽比較弱小，莖節(jié)間較短，如果直接切取叢生芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，不易直接生根，生根后移栽成活率也很低，所以增加壯苗培養(yǎng)階段來使節(jié)間增長，培養(yǎng)壯苗。

4.4 激素種類對芽誘導(dǎo)的影響

有研究表明BA配合IAA使用有利于芽的分化[7,10]，本試驗采取BA與NAA配合使用來誘導(dǎo)叢生芽，誘導(dǎo)效果較好，與Compton和Gray研究結(jié)果一致[3]，在含有BA的培養(yǎng)基中加入IAA時，增加愈傷組織形成，卻阻止芽的形成，這一差異或許與試驗選用的基因型材料不同有關(guān)。

4.5 解決玻璃化現(xiàn)象的方法

小西瓜試管苗在叢生芽誘導(dǎo)和繼代過程中，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重?？梢酝ㄟ^提高瓊脂和鐵鹽的濃度，降低硝酸鹽濃度等手段來解決，這與劉獨臣等研究結(jié)果一致[7]。對培養(yǎng)溫度和繼代時間也較為敏感，溫度高于25℃時，繼代時間超過15 d，玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。選取不同的小型西瓜試材試驗，基因型不同，誘導(dǎo)率和馴化成活率可能會有差異，這部分工作還有待于在今后工作中進(jìn)一步研究探討。

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[2]許智宏,衛(wèi)志明,劉桂云.用離體培養(yǎng)無性系繁殖三倍體無籽西瓜[J].植物生理學(xué)報,1979,5(3):245-251.

[3]Choi P S,Soh W Y,Kim Y S.Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Reports,1994,13:344-348.

[4]Compton M E,Gray D J.Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of tetraploid watermelon[J].Hort Science,1994,29:211-213.

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[8]張全美.西瓜植株高校再生體系建立及四倍體離體誘導(dǎo)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2004.