HPLC-PAD法同時測定精制銀翹解毒膠囊中對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷的含量

仇其原，鄧曉文，姚立娟

江蘇省鹽城藥品檢驗(yàn)所，鹽城224001

HPLC-PAD法同時測定精制銀翹解毒膠囊中對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷的含量

仇其原，鄧曉文，姚立娟

江蘇省鹽城藥品檢驗(yàn)所，鹽城224001

目的：采用HPLC-PAD法同時測定精制銀翹解毒膠囊中對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷的含量。方法：色譜柱：Capcell Pak C18（150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水（含0.25%的冰醋酸）梯度洗脫；檢測波長：300 nm和228 nm；流速：1m L·m in-1；柱溫：30℃。結(jié)果：對乙酰氨基酚測定的線性范圍28.15～84.45μg（r=0.9999），平均含量為235.06mg·g-1，RSD為0.17%；綠原酸測定的線性范圍0.2048～0.6144μg（r=0.9998），平均含量為1.91mg·g-1，RSD為0.21%；連翹苷測定的線性范圍0.1054～0.3162μg（r=0.9994），平均含量為1.00mg·g-1，RSD為0.32%；牛蒡苷測定的線性范圍1.044～3.132μg（r=0.9998），平均含量為7.04mg·g-1，RSD為0.16%。結(jié)論：該法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于精制銀翹解毒膠囊的質(zhì)量控制。

精制銀翹解毒膠囊；對乙酰氨基酚；綠原酸；連翹苷；牛蒡苷；高效液相色譜法

精制銀翹解毒膠囊處方由牛蒡子、金銀花、甘草、連翹等10味中藥和對乙酰氨基酚組成，具有清熱散風(fēng)、解毒退燒的功效。臨床上用于治療扁桃體炎、咽炎、上呼吸道感染等病癥。精制銀翹解毒膠囊目前使用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家標(biāo)準(zhǔn)[WS3-99（X-69）-99（Z）]。該標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)是用紫外分光光度法[1]僅對對乙酰氨基酚的含量進(jìn)行了測定；該法操作繁瑣，干擾因素多，容易引起誤差。目前文獻(xiàn)報道對乙酰氨基酚含量測定方法有TLCS法[2]、永停滴定法[3]、GC法[4]、HPLC法[5]等；而處方中同樣具有重要療效的中藥如金銀花的有效成分綠原酸、連翹的有效成分連翹苷、牛蒡子的有效成分牛蒡苷等均未做定量檢測。

本文運(yùn)用HPLC-PAD法[6]同時對對乙酰氨基酚[7]、綠原酸[8]、連翹苷和牛蒡苷4種成分含量進(jìn)行檢測；該法專屬性高、重復(fù)性好、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確；本法似可作為精制銀翹解毒膠囊的含量測定方法，以更好地對該產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695高效液相色譜儀、Waters2996二極管陣列紫外檢測器（PAD）、Empower色譜工作站（美國waters公司）；XS205 DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

對照品：對乙酰氨基酚（批號100018～200408）、綠原酸（批號110753～200413）、連翹苷（批號110821～200711）、牛蒡苷（批號110819～201007）均購自中國藥品生物制品檢定所。

供試品：精制銀翹解毒膠囊（貴州恒和制藥有限公司，批號110205、111101）；甲醇、乙腈（色譜純）；水（純化水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 不同流動相條件的考察吸取供試品溶液進(jìn)樣分析，分別以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%冰醋酸、乙腈-0.25%冰醋酸[9]等不同濃度、不同比例的流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫實(shí)驗(yàn)，比較不同流動相系統(tǒng)以及不同梯度洗脫條件的色譜圖，選擇分離效果最好，時間盡可能短的最佳流動相條件。

2.1.2 檢測波長的選擇通過PAD檢測器，對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷4種成分色譜峰于200～400 nm[10]波長掃描，選擇合適波長進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果選擇300 nm作為對乙酰氨基酚和綠原酸的檢測波長；228 nm作為牛蒡苷和連翹苷的檢測波長。

2.1.3 色譜條件最終選擇的色譜條件：色譜柱為Capcell Pak C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-水-冰醋酸，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為300 nm和228 nm；流速為1mL·min-1；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL。理論塔板數(shù)按對乙酰氨基酚峰計(jì)不低于4000。

表1 乙腈-水（含冰醋酸0.25%）流動相梯度洗脫比例

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液取對乙酰氨基酚28.15mg，置于10mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻得每1mL含2.815mg對乙酰氨基酚的對照品溶液。另取綠原酸對照品10.24mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻；另取2mL綠原酸溶液置10mL量瓶中，定容至刻度，制得每l mL含0.02048mg綠原酸的對照品溶液。另取連翹苷對照品10.54mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻；另取5mL連翹苷溶液置50mL量瓶中，定容至刻度，制得每lmL含0.01054mg連翹苷的對照品溶液。另取牛蒡苷對照品10.44mg，置于100mL量瓶中，加50%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，制得每lmL含牛蒡苷0.1044 mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取精制銀翹解毒膠囊10粒，精密稱定，內(nèi)容物研細(xì)后，稱取0.5956 g，置于50 mL的量瓶中，加50%的甲醇40mL，浸漬約30min，超聲處理30min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得[11]。

2.2.3 空白對照溶液分別按缺少對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷的處方比例進(jìn)行配制，方法見“2.2.2”項(xiàng)下，得到空白對照溶液。分別繪制兩個波長的空白對照圖譜，見圖1。

圖1 空白對照圖譜（A）300 nm；（B）228 nm

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

按所給色譜條件將對照品溶液、陰性對照品、供試品溶液分別進(jìn)樣20μL，測定峰面積并記錄色譜圖，結(jié)果供試品色譜峰（見圖2、圖4）中，在各對照品色譜峰（見圖3、圖5）的相應(yīng)位置上有保留時間相同的色譜峰；并且陰性樣品（見圖1）在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上無對應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，陰性樣品對測定結(jié)果無干擾。對乙酰氨基酚峰、綠原酸峰、連翹苷峰和牛蒡苷峰的理論塔板數(shù)均高于4000，分離度大于2.0，符合要求。

圖2 供試品在228 nm處色譜圖峰3為連翹苷；峰4為牛蒡苷

圖3 對照品在228 nm處色譜圖峰3為連翹苷；峰4為牛蒡苷

圖4 供試品在300 nm處色譜圖峰1為對乙酰氨基酚；峰2為綠原酸

圖5 對照品在300 nm處色譜圖峰1為對乙酰氨基酚；峰2為綠原酸

2.4 線性關(guān)系的考察

取對照品儲備液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10、15、20、25、30μL測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對乙酰氨基酚的回歸方程為：Y=1.492×105X-1.191×104，r= 0.9999，線性范圍在28.15～84.45μg，呈良好線性關(guān)系；綠原酸的回歸方程為：Y=2.179X×106-1.191× 104，r=0.9998，線性范圍在0.2048～0.6144μg，呈良好線性關(guān)系；連翹苷的回歸方程為：Y=5.085X×105-1.293×105，r=0.9994，線性范圍在0.1054～0.3162μg，呈良好線性關(guān)系；牛蒡苷的回歸方程為：Y=1.526X× 106-6.118×105，r=0.9998，線性范圍在1.044～3.132 μg，呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取各對照品溶液，進(jìn)樣量為10μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷峰面積的RSD分別為0.27%、0.21%、0.32%和0.36%。表明精確度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液連續(xù)5次進(jìn)樣，測定該份樣品中對乙酰氨基酚平均含量為235.06mg·g-1，RSD為0.68%；綠原酸平均含量為1.91mg·g-1，RSD為0.72%；連翹苷平均含量為1.00 mg·g-1，RSD為0.48%；牛蒡苷平均含量為7.04 mg·g-1，RSD為0.76%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號：111101）內(nèi)容物1份，按照“2.2.2”項(xiàng)下配制供試品方法操作，按照“2.1”色譜條件分析，分別在0、4、12、24、48 h測定，結(jié)果5次所得的對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷峰面積值的RSD均小于2%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：111101）內(nèi)容物9份[12]，每份約0.28 g，精密稱定，分別置于50mL量瓶中。由平均裝量和樣品測定項(xiàng)下所得含量（mg/粒）計(jì)算對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷的含量（mg），每份各加入一定量的對照品，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣20μL，按外標(biāo)法計(jì)算9份溶液中對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷和牛蒡苷的量，結(jié)果見表2。

2.9 樣品測定

取樣品（批號：111101）20粒，稱得平均裝量，將內(nèi)容物混勻，研細(xì)，稱取約0.6 g，置于50mL量瓶中，加50%的甲醇40mL，浸漬約30min，超聲處理30min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣20μL，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹苷及牛蒡苷的含量（mg/粒），同法測定另外一批的含量，結(jié)果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg·g-1）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 波長的選擇選擇波長為228 nm和300 nm。通過各對照品溶液在200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測顯示，對乙酰氨基酚最大吸收波長為245 nm，綠原酸最大吸收波長為326 nm，連翹苷最大吸收波長為228 nm，牛蒡苷最大吸收波長為227 nm。在300 nm處，對乙酰氨基酚和綠原酸均有吸收，且線性關(guān)系良好，兼顧各組分的檢測信號強(qiáng)度和檢測靈敏度，故選擇300 nm作為檢測波長；牛蒡苷和連翹苷在228 nm附近處均有最大吸收，故選擇228 nm作為檢測波長。

3.1.2 流動相的考察精制銀翹解毒膠囊組成復(fù)雜，其中各種活性成分的化學(xué)性質(zhì)差異較大。本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)過程中分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%冰醋酸、乙腈-0.25%冰醋酸等不同濃度、不同比例的流動相系統(tǒng)，進(jìn)行等度和梯度洗脫實(shí)驗(yàn)，比較不同流動相系統(tǒng)以及不同梯度洗脫條件的色譜圖，選擇分離效果最好、時間盡可能短的最佳流動相條件。而采用乙腈-0.25%冰醋酸作流動相，進(jìn)行梯度洗脫可將4個組分完全分離。

3.2 供試品溶液提取條件的考察

3.2.1 提取時間的優(yōu)化在超聲提取時，比較了15、30、45、60min含量測定結(jié)果，結(jié)果表明，提取時間30、45、60min時，各組分峰面積不隨時間延長而有所增加，故超聲處理時間選用30min。

3.2.2 提取溶劑的選擇取供試品（批號：111101）研細(xì)后精密稱取約0.6 g，分別以有機(jī)溶劑甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇為溶劑，對乙酰氨基酚等4種成分含量測定分析，實(shí)驗(yàn)表明，提取溶劑為50%甲醇時，提取效率最高，故選擇其作為提取溶劑。

3.2.3 提取方式的選擇取供試品（批號：111101）研細(xì)后精密稱取約0.6 g，精密加入50%甲醇20 mL，稱定重量，分別采用超聲處理和熱回流的方式提取60min，測定供試品中各組分含量。實(shí)驗(yàn)表明，采用超聲處理與加熱回流的結(jié)果一致，對實(shí)驗(yàn)無影響，而超聲處理更加簡單易行，故選擇超聲處理。

3.3 色譜柱的考察

分別采用Capcell Pak C18色譜柱（150mm×4.6 mm，5μm）、Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）和Waters2695高效液相色譜儀，測定樣品中對乙酰氨基酚等成分的含量，長柱分離效果好，適合多種成分中藥分離，但出峰時間相對較長；短柱出峰時間短且主峰理論板數(shù)和分離度均符合要求，故選擇Capcell Pak C18色譜柱（150mm×4.6mm，5 μm）作為色譜柱。

[1]國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)[S].第16～26冊，30.

[2]屈愛桃，孫利民，溫愛萍，等.薄層掃描法測定三九感冒靈沖劑中對乙酰氨基酚及咖啡因的含量[J].中國藥房，2003，14（6）：365-6.

[3]王巧榮，宋志超，馮明霞.永停滴定法測定復(fù)方對乙酰氨基酚片中對乙酰氨基酚的含量[J].中國新醫(yī)藥，2003，2（5）：94-5.

[4]艾玉鎖，宋小京.GC法測定復(fù)方感冒靈片中對乙酰氨基酚和咖啡因的含量[J].中國藥事，2000，14（1）：36-7.

[5]林娟，陳自平.HPLC法測定氨咖黃敏膠囊中對乙酰氨基酚的含量[J].安徽醫(yī)藥，2004，8（3）：222-3.

[6]王守箐，王宏，李冠忠.HPLC-二極管陣列檢測器測定銀黃膠囊中綠原酸、黃芩苷含量[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，2003，22（2）：365.

[7]蓋軻，鄭阿利.高效液相色譜法同時測定氨咖黃敏膠囊中對乙酰氨基酚和咖啡因的含量[J].中國藥房，200，17（6）：456.

[8]劉祥蘭，劉重芳，張英，等.金銀花中綠原酸提取工藝的比較和優(yōu)化研究[J].中成藥，2000，22（6）：402.

[9]林茂，朱朝德，孫慶民，等.當(dāng)歸化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報，1979，14（9）：529.

[10]付向紅，付春華.RP-HPLC測定感冒靈膠囊中對乙酰氨基酚、綠原酸的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（10）：878-9.

[11]王學(xué)紅，梁建平，郭志廷，等.貫葉連翹中金絲桃素的提取及含量測定方法[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，13（1）：44-7.

[12]欒雨，曹云飛.RP-HPLC法測定抗感膠囊中綠原酸的含量[J].江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，16（1）：64-5.

Simultaneous Quantitative Determ ination of Paracetamol,Chlorogenic Acid, Forsythin and Arctinin in Jingzhi Yinqiao Jiedu Capsules by HPLC-PAD

QIU Qi-yuan,DENG Xiao-wen,YAO Li-juan
Yancheng Institute of Pharmaceutical Control,Yancheng 224001,China

Objective:To establish an HPLC method for the determination of paracetamol,chlorogenic acid,forsythin and arctinin in Jingzhi Yinqiao Jiedu capsules.Methods:The column was Capcell Pak C18(150mm×4.6mm,5μm);Acetonitrile-water(It contained 0.25%glacial acetic acid)constituted the mobile phase for gradient elution;The wavelengths for detection were 300 nm and 228 nm;The flow rate was at 1 mL·min-1;The column temperature was at 30℃.Results:For paracetamol,the linear range was 28.15～84.45μg(r=0.9999),the average content was 235.06mg·g-1and the Relative Standard Deviation(RSD)was 0.17%;For chlorogenic acid,the linear range was 0.2048～0.6144μg(r=0.9998),the average content was 1.91mg·g-1and the RSD was 0.21%;For forsythin,the linear range was 0.1054～0.3162μg(r=0.9994),the average content was 1.00mg·g-1and the RSD was 0.32%;For arctinin,the linear range was 1.044～3.132 μg(r=0.9998),the average content was 7.04mg·g-1and the RSD was 0.16%.Conclusion:This method is accurate,simple and reproducible for quantitative analysis of Jingzhi Yinqiao Jiedu capsules.

Jingzhi Yinqiao Jiedu capsules;Paracetamol;Chlorogenic acid;Forsythin;Arctinin;HPLC

R927.2

A

1673-7806（2012）05-402-04

仇其原，男，主管藥師E-mail:gita_80@126.com

2012-06-15

2012-07-25